牡蛎肽和紫苏籽肽及其复配物对环磷酰胺致雄性大鼠性功能损伤的改善作用

李明亮，姜 放，魏 颖*，张瑞雪，张海欣，蔡木易，谷瑞增

（1 中国食品发酵工业研究院 北京市蛋白功能肽工程技术研究中心 北京 100015 2 华狐生物科技（中国）有限公司 沈阳 110000）

具有特殊生理活性的小肽可以通过影响消化系统、内分泌系统、心血管系统、免疫系统等对人体机能产生积极影响[1]。低分子质量的肽比蛋白质或游离氨基酸更具生物利用度，通常表现出比母体蛋白更高的生物活性[1-2]。

食源性低聚肽主要来源于海洋生物和陆地动植物，其中海洋生物是结构多样的生物活性物质的储存库，包括蛋白质和多肽[3]，且海洋生物蛋白的氨基酸组成和排列顺序也不同于陆地生物。牡蛎是世界上范围最大的养殖贝类，已进入我国原卫生部公布的药食同源清单。牡蛎富含蛋白质，氨基酸组成完整，尤其富含牛磺酸[4]，多项研究表明牡蛎肽具有抗氧化、抗疲劳、增强免疫、保护肝脏和增强性功能等活性[5]。然而，海洋来源的生物活性肽一般具有带疏水性侧链的残基，有明显的苦味[3]。紫苏是我国原卫生部公布的第1 批药食同源作物[6]，紫苏籽蛋白湿重含量为20%～23%[7]，且氨基酸种类齐全，组成均衡[8]，可作为优质的活性肽来源。目前对紫苏肽的研究多集中在抗氧化特性上，已开发的紫苏肽功能较单一。

男性性功能障碍是一种常见病，发病率约占成年男性的10%[9]。血清中雄激素水平降低，肾脏或睾丸的病理状态都可严重损伤男性生育能力或引起性功能障碍。精氨酸对男性生殖有着重要作用，可以参与精子生成，促进精子运动，合成信号分子NO，延缓精子细胞膜脂质过氧化等[10]。研究发现，补充精氨酸或富含精氨酸的蛋白质和多肽可以改善机体的生殖损伤状况，提高男性生育能力和性功能。本课题前期研究发现，牡蛎肽和紫苏籽肽中富含精氨酸和其它多种功能性氨基酸，推测它们可能会对男性生殖和性功能产生积极影响。由于动物氮源比植物氮源更易被机体吸收和利用，因此本试验同时探究二者复配是否协同增效。

为了开发具有改善性功能损伤作用的低聚肽，本试验首先制备牡蛎肽和紫苏籽肽，通过氨基酸自动分析仪和高效液相色谱检测两种肽的氨基酸组成及相对分子质量。通过对雄性大鼠注射环磷酰胺造成大鼠的性功能损伤，对该模型大鼠灌胃牡蛎肽和紫苏籽肽及两者的复配物，探究两种肽及复配物对大鼠性功能损伤的改善作用。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

牡蛎肽和紫苏籽肽为实验室制备；L-精氨酸、西地那非，北京索莱宝科技有限公司；环磷酰胺，江苏盛迪医药有限公司；大鼠睾酮（T）ELISA 试剂盒、大鼠游离睾酮（FT）ELISA 试剂盒，南京森贝伽生物科技；Rodent FSH Elisa test kit、Rodent luteinizing hormone （LH） Elisa test kit，美国Endocrine Tech 公司；大鼠白蛋白（ALB）ELISA 试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；丙二醛（MDA）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

Spectra MR 多功能酶标仪，美国Dynex 公司；A300 氨基酸自动分析仪，德国membrapureGmbH公司；UDK-159 全自动凯氏定氮仪，意大利VELP公司；LC-20AD 型高效液相色谱仪，日本SHIMADZU 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 牡蛎肽和紫苏籽肽的制备及检测

牡蛎肽：牡蛎肉打浆→定容，调节pH 值→离心→酶解→离心→灭酶→陶瓷膜过滤，浓缩→过滤→灭菌→喷雾干燥→牡蛎肽

获得的牡蛎肽和紫苏籽肽参考GB 5009.5-2016 利用全自动凯氏定氮仪对样品中蛋白质含量进行测定；参考GB/T 22729-2008 对样品中酸溶蛋白含量进行测定，利用高效液相色谱仪对样品相对分子质量进行测定；参考GB 5009.124-2016 利用氨基酸自动分析仪对样品中氨基酸组成进行测定。

1.3.2 动物饲养及处理 100 只6 周龄SPF 级SD 雄性大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重（260±20） g，动物饲养在无菌环境，温度（20±2）℃。试验期间动物自由进食和饮水。以西地那非和精氨酸为阳性对照，大鼠随机分为10组，每组10 只，分别为空白组、模型组、西地那非组、精氨酸组、牡蛎肽低、高剂量组，紫苏籽肽低、高剂量组，复配低、高剂量组，除空白组外，其余各组每天腹腔注射环磷酰胺20 mg/kg，连续5 d，建立生殖损伤模型，空白组注射等体积生理盐水；西地那非灌胃剂量为5 mg/（kg·bw），精氨酸灌胃剂量为0.3 g/（kg·bw），各低剂量组灌胃剂量为0.3 g/（kg·bw），各高剂量组灌胃剂量为0.6 g/（kg·bw），复配比例为牡蛎肽∶紫苏籽肽=1∶1，连续灌胃6 周。

大鼠末次灌胃后禁食12 h，眼眶取血，血液于4 ℃下放置过夜，离心后收集血清于-80 ℃保存备用；大鼠麻醉后处死，收集大鼠肾脏和睾丸，称重后切取小部分组织经4%多聚甲醛固定，用于HE染色分析，剩余肾脏和睾丸组织经液氮速冻后保存于-80 ℃备用。

1.3.3 大鼠体重测定 灌胃前1 周至末次灌胃后1 周，各组大鼠每周称重并记录。

1.3.4 大鼠肾脏和睾丸指数测定 肾脏和睾丸组织称重并计算脏器指数，计算公式为：脏器指数（mg/g）=脏器质量（mg）/体重（g）。

1.3.5 血清指标的检测 根据试剂盒说明书，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠血清中睾酮（T）、游离睾酮（FT）、促黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、血清白蛋白（ALB）水平。

1.3.6 肾脏和睾丸抗氧化检测 将冷冻的肾脏和睾丸组织用预冷的生理盐水制成10%匀浆，按照试剂盒说明，检测超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH-Px） 活力以及丙二醛（MDA）含量。

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1.3.7 睾丸HE 染色 适当大小的肾脏和睾丸组织经4%多聚甲醛固定24 h，经脱水、包埋、切片、脱蜡，苏木精-伊红（HE）染色，在显微镜下观察并拍照。

1.4 统计分析

采用Prism 8.0 软件对试验结果进行数据处理及绘图，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和多重比较（multiple comparisons），试验结果以均值±标准差（±s）表示，P＜0.05 具有显著性差异，P＜0.01 具有极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 牡蛎肽和紫苏籽肽的检测结果

组成蛋白质的氨基酸有20 种，包括8 种必需氨基酸和其它具有特殊功能的功能性氨基酸。精氨酸可以促进部分激素分泌，维持骨骼肌功能，以及作为生成信号分子NO 的底物[11]，此外还可以参与精子生成[10]；半胱氨酸可以通过代谢产生谷胱甘肽参与自由基消除反应；脯氨酸通过其代谢产物5-吡咯啉羧酸进而调控细胞增殖和DNA 合成以及影响促进精子生成的多胺类物质的合成；谷氨酸可以作为核苷酸合成的能量底物[10]；赖氨酸可以促进矿物吸收和骨骼生长[12]；天冬氨酸可以参与核苷酸代谢，促进细胞周期进程[13]；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸还具有促进蛋白合成，清除自由基，保护线粒体等作用[14]。氨基酸组成检测结果如表1所示：牡蛎肽和紫苏籽肽都含有多种功能性氨基酸，尤其富含天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸，其中紫苏籽肽的谷氨酸和精氨酸含量显著高于牡蛎肽，牡蛎肽的赖氨酸含量显著高于紫苏籽肽。高效液相色谱分析结果见表2，牡蛎肽的平均相对分子质量显著低于紫苏籽肽，分子质量低于1 000 的肽段所占比例也比紫苏籽肽显著提高，二者的蛋白质含量和酸溶蛋白含量则无显著差异。

表2 牡蛎肽和紫苏籽肽的蛋白含量与分子质量Table 2 Protein content and molecular weight of oyster peptide and perilla seed peptide

2.2 牡蛎肽和紫苏籽肽对大鼠体重的影响

图1为在灌胃处理前1 周到末次灌胃后1 周大鼠体重随时间变化，图2为末次灌胃1 周后大鼠体重与初始体重相比的增加量。可以看出，灌胃开始前各组大鼠的体重没有显著差别，在第7 周时，复配低、高剂量组、精氨酸组和模型组大鼠体重高于空白组，紫苏籽肽低、高剂量组和牡蛎肽低、高剂量组以及西地那非组大鼠体重低于空白组，但是各组与空白组之间没有显著性差异。在第7 周时，除模型组，复配高剂量组，牡蛎肽低、高剂量组外，其余各组大鼠体重都出现了一定程度的下降，其原因需要进一步研究讨论。

图1 7 周干预期内大鼠体重变化Fig.1 Changes in rat body weight during the seven-week intervention period

图2 7 周后大鼠体重增长量Fig.2 Weight gain after seven weeks

2.3 牡蛎肽和紫苏籽肽对大鼠脏器指数的影响

由表3大鼠肾脏和睾丸的脏器指数测定结果可知，各组的肾脏指数与模型组相比并无显著差异，但是模型组睾丸指数相比于空白组显著下降（P＜0.05），是空白组的77.95%，两个阳性对照组的睾丸指数相比于模型组有显著提高，各处理组睾丸指数相比于模型组也显著提高，其中牡蛎肽低、高剂量组分别是空白组的93.83%和99.69%，紫苏籽肽低、高剂量组分别是空白组的95.51%和96.76%，复配低、高剂量组分别是空白组的97.39%和100.84%，可以看出牡蛎肽和紫苏籽肽都可显著提高模型大鼠的睾丸指数，且二者的复配作用效果略强于单独的牡蛎肽或紫苏籽肽。

表3 大鼠肾脏与睾丸的脏器指数Table 3 Organ index of rat kidney and testis

2.4 牡蛎肽和紫苏籽肽对大鼠血清指标的影响

睾酮（T）是主要的雄激素，血液中的游离睾酮（FT）通过循环到达目标细胞后，结合和激活雄激素受体进而发挥作用，是精子发生和男性生殖所必需的，成人睾酮缺乏会增加身体脂肪和疲劳，降低肌肉质量、骨密度、认知功能和免疫反应[15]。促性腺激素包括卵泡刺激素 （FSH） 和黄体生成素（LH）[16]，在睾丸中，FSH 与支持细胞膜上的受体结合可促进精子发生[17]，LH 与间质细胞膜上的受体结合可促进睾酮合成[18]，它们协调调节睾丸功能，促进睾酮合成，维持正常的精子发生，精子的健康和密度。

如图3所示，模型组T 水平相比于空白组显著降低（P＜0.05），是空白组的77.63%，两个阳性对照组T 水平相比于模型组均有不同程度提高，牡蛎肽低、高剂量组T 水平相比于模型组都显著升高，分别是模型组的1.33 和1.29 倍，紫苏籽肽低、高剂量组T 水平分别是模型组的1.17 和1.24 倍，复配低、高剂量组分别是模型组的1.28 和1.26倍；模型组FT 水平相比于空白组有所下降，是空白组的90.00%，两个阳性对照组FT 水平相比于模型组均有不同程度提高，牡蛎肽低、高剂量组FT 水平分别是模型组的1.49 和1.52 倍，紫苏籽肽低、高剂量组FT 水平分别是模型组的1.29 和1.14 倍，复配低、高剂量组FT 水平分别是模型组的1.37 和1.32 倍；模型组FSH 水平相比于空白组有所下降，是空白组的86.50%，两个阳性对照组FSH 水平相比于模型组没有显著差别，牡蛎肽低、高剂量组FSH 水平分别是模型组的1.49 和1.01 倍，紫苏籽肽低、高剂量组FSH 水平分别是模型组的1.23 倍和1.00 倍，复配低、高剂量组FSH 水平分别是模型组的1.20 和1.28 倍；模型组LH 水平相比于空白组极显著下降（P＜0.01），是空白组的28.89%，阳性对照组中精氨酸组LH 水平相比于模型组显著提高，牡蛎肽低、高剂量组LH水平分别是模型组的4.21 和3.56 倍，紫苏籽肽低、高剂量组LH 水平分别是模型组的3.51 倍和3.92 倍，复配低、高剂量组LH 水平分别是模型组的3.46 和3.39 倍。可以看出，牡蛎肽和紫苏籽肽都可提高模型大鼠血清中雄激素和促性腺激素水平，牡蛎肽的作用效果强于紫苏籽肽，复配组的作用效果强于同等剂量的紫苏籽肽。

图3 血清雄激素和促性腺激素水平Fig.3 Serum androgen and gonadotropin levels

白蛋白（ALB）是血浆中最丰富的蛋白质，具有多种生物学功能，例如维持血压、营养支持、抗氧化、运输和排毒作用[19-20]，低血清白蛋白水平与多种疾病以及老年人认知障碍有关[21-22]，在营养不良和炎症等状况下，血清白蛋白水平都会下降[23]。

由图4可以看出，模型组ALB 水平相比于空白组有所下降，是空白组的89.19%，精氨酸组ALB 水平相比于模型组有所提高，但并无显著性差别，牡蛎肽低、高剂量组ALB 水平分别是模型组的1.44 和2.04 倍，紫苏籽肽低、高剂量组分别是模型组的1.08 和1.25 倍，复配低、高剂量组ALB 水平分别是模型组的1.33 和1.61 倍。可以看出，牡蛎肽对大鼠血清中ALB 水平的提升作用最强，复配组的作用效果强于等剂量的紫苏籽肽。

图4 血清白蛋白水平Fig.4 Serum albumin levels

2.5 肾脏和睾丸抗氧化检测结果

SOD 是重要的抗氧化酶，能将O2-还原为H2O2，GSH-Px 可与H2O2反应，通过氧化还原型谷胱甘肽[24]，达到防止细胞脂质过氧化的作用[25]。MDA 是细胞膜脂质过氧化的最终产物，可以用来评价细胞脂质过氧化程度。

由图5可以看出，模型组和空白组以及阳性对照组之间SOD 活力并无显著差异，各处理组之间相比于模型组都有极显著差异（P＜0.01），其中牡蛎肽低、高剂量组SOD 活力分别是模型组的2.49 和2.31 倍，紫苏籽肽低、高剂量组SOD 活力分别是模型组的2.34 和2.56 倍，复配低、高剂量组SOD 活力分别是模型组的2.23 和2.27 倍；模型组MDA 含量相比于空白组显著升高，是空白组的1.46 倍，精氨酸组MDA 含量相比于模型组有所下降，但无显著性差异，牡蛎肽高剂量组和紫苏籽肽低剂量组MDA 含量相比于模型组都显著降低，分别是模型组的60.13%和67.06%，两个复配组中MDA 含量也有所下降，且与紫苏籽肽两组作用效果没有显著差异；模型组GSH-Px 活力低于空白组，是空白组的86.88%，两个阳性对照组GSH-Px 活力相比于模型组有所提高但无显著性差异，牡蛎肽低、高剂量组GSH-Px 活力相比于模型组出现了进一步下降，分别是模型组的97.65%和92.98%，紫苏籽肽低、高剂量组GSH-Px 活力相比于模型组有所提高，分别是模型组的1.26 和1.28 倍；两个复配组中GSH-Px 活力相比于模型组有所提高，分别是模型组的1.05 倍和1.04 倍，低于紫苏籽肽组，但相比于牡蛎肽组有所提高。可以看出牡蛎肽和紫苏籽肽都可以改善模型大鼠肾脏的氧化应激状态，且紫苏籽肽的综合效果强于牡蛎肽。

图5 肾脏抗氧化检测Fig.5 Detection of renal antioxidant

由图6可以看出，模型组SOD 活力相比于空白组极显著下降（P＜0.01），是空白组的69.68%，精氨酸组和各处理组相比于模型组SOD 活力都有所提高但都无显著性差异，其中牡蛎肽低、高剂量组SOD 活力分别是模型组的1.15 和1.04 倍，紫苏籽肽低、高剂量组SOD 活力分别是模型组的1.07 和1.15 倍，复配低、高剂量组SOD 活力分别是模型组的1.13 和1.14 倍；模型组MDA 含量相比于空白组显著升高（P＜0.05），是空白组的1.42倍，两个阳性对照组MDA 含量相比于模型组都显著下降，牡蛎肽低、高剂量组MDA 含量分别是模型组的1.06 倍和95.16%，紫苏籽肽低、高剂量组MDA 含量分别是模型组的62.39%和80.37%，复配低、高剂量组MDA 含量分别是模型组的91.38%和89.25%；模型组GSH-Px 活力相比于空白组极显著降低（P＜0.01），是空白组的71.64%，两个阳性对照组GSH-Px 活力相比于模型组都有所提高，尤其是精氨酸组极显著提高（P＜0.01），牡蛎肽低、高剂量组GSH-Px 活力分别是模型组的1.25 和1.09 倍，紫苏籽肽低、高剂量组GSH-Px活力分别是模型组的1.62 和1.61 倍，复配低、高剂量组GSH-Px 活力分别是模型组的1.46 和1.43倍。可以看出牡蛎肽和紫苏籽肽都可改善模型大鼠睾丸的氧化应激状态，且紫苏籽肽的作用效果强于牡蛎肽。

图6 睾丸抗氧化检测Fig.6 Detection of testis antioxidant

2.6 肾脏和睾丸HE 染色分析

由睾丸HE 染色结果可见，空白组生精小管基膜完整，生精上皮较厚，生精细胞层次和数量丰富，大量生精细胞和支持细胞排列紧密有序，形态规则正常，管腔形状规则，管腔中可见大量精细胞。模型组生精小管的生精上皮变薄，生精细胞数量锐减，生精细胞和支持细胞排列稀疏，部分生精细胞脱落至管腔中，管腔中形成明显空腔。各处理组尤其是各高剂量组相比于模型组睾丸形态出现了明显改善，生精细胞数量明显增加，管腔中空腔情况明显改善。

图7 睾丸HE 染色Fig.7 HE staining of testis

如图8所示，空白组肾小囊腔明显，血管球形态正常，基膜完整，肾小管形态正常；模型组肾小体肿胀增大变形，球内细胞增加，肾小囊腔变小，毛细血管间间隙增大；各处理组的肾小体肿大变形状况得到了一定程度的改善。

图8 肾脏HE 染色Fig.8 HE staining of kidney

3 结论

环磷酰胺的代谢物通过形成共价DNA 加合物显示细胞抑制作用[26]，与睾丸生化和组织学改变有关，环磷酰胺造成的生殖损害主要是因为氧化应激、脂质过氧化、DNA 损伤和谷胱甘肽水平降低[27]，从而造成促性腺激素分泌紊乱、睾丸损伤和血浆睾酮水平降低。本试验采用环磷酰胺致雄性大鼠性功能损伤模型，结果显示，牡蛎肽和紫苏籽肽以及二者的复配都可以提高模型大鼠睾丸指数以及血清中雄激素和促性腺激素水平，提高血清白蛋白水平，改善肾脏和睾丸的氧化应激状态和组织结构变化，从而改善模型大鼠的生殖损伤状况。牡蛎肽对模型大鼠血清雄激素和促性腺激素的影响最突出，紫苏籽肽对肾脏和睾丸氧化应激状态的改善作用强于牡蛎肽，二者的复配可以显著提高受损伤大鼠的睾丸指数，作用效果优于单一干预组，且对肾脏和睾丸抗氧化能力的提升效果优于单独的牡蛎肽，对血清雄激素和促性腺激素水平的提升效果优于单独的紫苏籽肽。综上所述，牡蛎肽、紫苏籽肽及复配均具有较好的改善雄性大鼠性功能的作用。根据本课题研究结果，可为开发改善男性性功能障碍的功能性食品奠定理论基础。