细叶小檗碱的抑菌稳定性及其对细菌蛋白质的影响

张俊顺，高铭坤，郭 阳，骆嘉原，包怡红，3*，符 群，3，张海婷

（1 东北林业大学林学院 哈尔滨 150040 2 中国农业大学动物科学技术学院 北京 100193 3 黑龙江省森林食品资源利用重点实验室 哈尔滨 150040）

细叶小檗（Berberis poiretii）为小檗科小檗属浆果，分布广泛，主要集中在我国西部地区，有250 余种，约占世界的50%[1-2]。细叶小檗含有的生物碱有小檗碱、小檗胺和苦参碱等活性物质[3-4]，其中小檗碱含量高且具有较强的生物活性[5-6]，具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血压等功能[7-11]。细叶小檗在我国具有悠久的使用历史，传统的药用部位和现代研究大多集中在根、茎等部位，而细叶小檗果实在临床研究及食品研发方面同样具有巨大利用价值[12]。Ding 等[13]对小檗碱的抑菌活性进行了研究，发现小檗碱具有较好的抑菌活性。郭乙冰等[14]发现小檗碱治疗炎症性肠道疾病的能力较强，具有防治该疾病的潜在优势。Qin 等[15-16]研究发现小檗碱对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。Liu 等[17]研究发现小檗碱可显著降低血糖和胰岛素水平，改善肝脏中脂肪的积累。

蛋白质是生命体遗传信息的翻译产物与生物生命活动的主要承担者，细菌的正常代谢及繁殖等生命活动离不开蛋白质的参与[18]。生物碱作为一类重要的活性物质，来源广泛，在食品中有较大的开发利用价值，如茶叶中的咖啡碱可取代部分食品添加剂和药物，番茄中的青果碱具有开发成为天然食品防腐剂的潜力[19]。如今生物碱等小分子类活性物质与蛋白质的相互作用关系成为近年来的研究热点。研究小檗碱对细菌蛋白质的作用对研究其药理作用以及在食品防腐方面的应用具有重要意义。本试验研究细叶小檗果实中的小檗碱对食品中常见的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性，通过紫外线照射、温度和pH 值的变化研究其稳定性，探究小檗碱对菌体中蛋白质的影响，也是对小檗碱抑菌稳定性研究的重要补充，为天然产物中生物碱的抑菌机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

细叶小檗果实，购于黑龙江省鹤岗市。4 种供试菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和大肠杆菌（Escherichia coli），东北林业大学微生物试验室提供；Y31J9H67024 小檗碱标准品（纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司。

牛肉膏、蛋白胨、MH（B）培养基、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、丙烯酰胺、叔丁醇、氢氧化钠等均为分析纯试剂，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 仪器与设备

超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-5500PC 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；HZQ-F 全温振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；台式离心机，上海安亭科学仪器厂；DYY-5D 型电泳仪电源，北京市六一仪器厂；电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的测定 准确称量小檗碱标准品2.5 mg，无水乙醇溶解，于25 mL 容量瓶中定容。分别吸取0.5，1，1.5，2，2.5 mL 于25 mL 容量瓶定容，于波长345 nm 处测定吸光度值[20]，小檗碱质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标，计算得标准曲线方程：y=0.0327x＋0.1261，R2=0.9996。

1.3.2 小檗碱的提取 将细叶小檗的果实洗净，25 ℃干燥至恒重，粉碎后过100 目筛，制得小檗果实粉末备用。准确称取20 g 粉末置于27%的乙醇溶液，按照液料比32∶1，300 W 超声功率进行提取小檗碱[21]。使用紫外可见分光光度计测定吸光度，由标准曲线方程计算小檗碱浓度。

1.3.3 小檗碱抑菌活性的测定 采用滤纸片法测定小檗碱对4 种菌的抑菌活性[22]。无菌条件下，将培养基倒入灭过菌的平板冷却凝固后，取100 μL菌悬液于培养基上并涂布均匀，4 片无菌滤纸片（直径为6 mm） 放置于含菌平板上，其中3 片每片滴加10 μL 质量浓度为4.10 mg/mL 的小檗碱，另一片滴加等量无菌水作为对照，放置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h，测量抑菌圈直径大小。

1.3.4 最低抑菌浓度的测定 将小檗碱提取液进行二倍稀释，无菌96 孔板内滴加20 μL 的4 种供试菌种菌液（107CFU/mL），90 μL 液体培养基，90 μL的不同浓度的提取液，对照组加入等量无菌水，37℃培养12 h 后，每孔取100 μL 涂布平板，37 ℃恒温培养12 h 后，以第1 个出现单菌落平板中的小檗碱的浓度为最低抑菌浓度[23]。

1.3.5 温度对小檗碱抑菌活力变化率的影响 将同浓度的小檗碱在4，25，50，80 和100 ℃的温度下处理15 min，冷却至室温进行抑菌试验[24]，抑菌圈直径用L1 表示，L0 表示对照组的抑菌圈直径，抑菌活力变化率根据以下公式进行计算。

1.3.6 pH 值对小檗碱抑菌活力变化率的影响用1 mol/L 的NaOH 溶液和1 mol/L 的HCL 溶液调小檗碱pH 值分别为2，4，6，8，10，静置15 min后，调回原pH 值，以蒸馏水作为对照，进行抑菌试验[25]，观察并测量不同pH 值下对4 种供试菌抑菌圈的大小，根据公式（1）计算抑菌活力变化率。

1.3.7 紫外线照射对小檗碱抑菌活力变化率的影响 将浓度相同的小檗碱分别在紫外灯（功率为20 W，垂直距离30 cm） 下照射10，20，30，40，50 min，对照组不进行处理，进行抑菌试验，观察并测量不同紫外线照射时间下的抑菌圈的大小[26]，根据公式（1）计算抑菌活力变化率。

1.3.8 小檗碱对细菌细胞外蛋白质浓度的影响

4 种供试菌培养12 h 至对数生长期，试验组菌悬液加入1 MIC 的小檗碱，对照组菌悬液加入等量的无菌磷酸盐缓冲液（PBS） 0.1 mol/L，置于37℃的恒温振荡培养箱，120 r/min，培养6 h 后取出，6 000 r/min 离心15 min，取上清液，采用考马斯亮蓝法，用紫外分光光度计于595 nm 处测定吸光值[27]。

1.3.9 小檗碱对细菌细胞内蛋白质浓度的影响4 种供试菌培养12 h 至对数生长期，试验组菌悬液加入1 MIC 的小檗碱，对照组菌悬液加入等量0.1 mol/L PBS，置于37 ℃的恒温振荡培养箱，120 r/min，培养6 h 后取出，8 000 r/min 离心15 min，收集菌体，使用0.1 mol/L 无菌PBS 洗涤3 次，超声破碎细胞（破碎条件：工作5 s，间歇15 s，共10 min，功率400 W），8 000 r/min，离心15 min，取上清液备用，以牛血清蛋白作为标准品，采用考马斯亮蓝法，使用紫外分光光度计于595 nm 处测定吸光值[28]。

1.4 小檗碱对细菌蛋白质合成的影响

1 MIC 的小檗碱加入至4 种供试菌种的菌悬液（107CFU/mL），对照组加入等量无菌磷酸缓冲溶液（PBS），37 ℃培养12 h 后，5 000 r/min 离心15 min，弃上清液后，PBS 清洗3 次，加入20 μL 上样缓冲溶液，沸水浴5 min，5 000 r/min 离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE 分析[29]。

1.5 数据统计分析

用Excel 2010 与SPSS20 软件进行数据统计与分析，组间数据比较采用单因素ANOVA 分析、Duncan 多重比较分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义，数据处理结果表示为“平均值±标准差”的形式。

2 结果与分析

2.1 小檗碱的抑菌活性及最低抑菌浓度的测定

小檗碱对4 种供试菌的抑菌圈直径如表1所示，细叶小檗果小檗碱对4 种供试菌都出现了抑菌圈，且具有不同直径，表明小檗碱对4 种供试菌有较好的抑制作用，其中对大肠杆菌的最低抑菌浓度为2.40 mg/mL，在4 种MIC 值中最小，且抑菌圈直径最大，为（11.6±0.11）mm，表明小檗碱对大肠杆菌的抑制效果最好，原因可能是大肠杆菌为革兰氏阴性细菌，与革兰氏阴性细菌相比，其细胞壁更厚，结构更加致密，对小檗碱具有一定的阻碍作用，难以进入细胞内，因此对其抑菌效果减弱。

表1 小檗碱对4 种供试菌种的DIZ 及MIC 值Table 1 DIZ and MIC values of berberine against 4 tested bacteria

2.2 温度对小檗碱抑菌活力变化率的影响

不同温度处理对小檗碱抑菌活力变化率的影响如图1所示，当温度依次由4 ℃到100 ℃时，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌活力变化率均呈降低趋势，分别降至-8.51%，-8.32%，-7.89%和-8.93%，即随着温度的升高，小檗碱的抑菌活力降低。原因可能是小檗碱的热稳定性较差，高温会破坏小檗碱的结构，部分小檗碱发生降解，从而降低了部分小檗碱的活性。包怡红等[30]通过研究小檗碱的热降解模型，发现高温会破坏小檗碱的结构，发生降解且热降解速率随着温度的升高而加快，因此抑菌活性也随着温度升高而降低，得出小檗碱最宜储存温度在60 ℃以下，在温度高于90 ℃处理20 h 会使小檗碱完全失活。

图1 温度对小檗碱抑菌活力变化率的影响Fig.1 Effect of temperature on the rate of berberine antibacterial activity

2.3 pH 值对小檗碱抑菌活力变化率的影响

pH 值对小檗碱抑菌活力变化率的影响如图2所示，当pH 值为6 时，小檗碱对4 种供试菌的抑菌活力变化率趋近于0；当pH＜6 时，其抑菌活力变化率为负值，且pH 值越低其抑菌活力减小，当pH 值为2 时，小檗碱对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活力变化率降至最低，分别为-10.45%，-11%，-9.4%和-12%。当pH＞6 时，小檗碱对4 种供试菌的抑菌活力变化率也开始降低，当pH 值为10 时，降至最低，分别为-5.9%，-6.8%，-8%和-8.23%，表明强酸或强碱会破坏小檗碱的结构，导致其抑菌活性降低。在强酸或强碱的条件下稳定性较差，可能由于小檗碱带有正电荷，易与带有负电荷离子或分子结合，结构发生变化，抑菌活性降低[31]。当pH≥6.8 时，小檗碱的结构会发生变化，由抑菌效果较好的季铵型转化为醛型或醇型结构，导致抑菌效果降低[32]。

图2 pH 值对小檗碱抑菌活力变化率的影响Fig.2 Effect of pH on the rate of berberine antibacterial activity

2.4 紫外线照射对小檗碱抑菌活力变化率的影响

由图3可知，随着紫外线照射时间延长（10～50 min），小檗碱的抑菌活力变化率始终保持在-3%与4%之间，基本未发生变化，说明紫外线照射对小檗碱的抑菌活力基本没有影响，小檗碱的结构与抑菌性能不受紫外线照射的影响，在紫外线照射的条件下具有较好的稳定性。

图3 紫外线照射对小檗碱抑菌活力变化率的影响Fig.3 Effect of ultraviolet irradiation on the rate of berberine antibacterial activity

2.5 小檗碱对细菌细胞外蛋白质浓度的影响

由图4可知，加入1 MIC 小檗碱的枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞外蛋白质质量浓度分别增加0.0194，0.007，0.0263 和0.0125 mg/mL，与未加入小檗碱的对照组相比均显著增加（P＜0.05）。原因可能是小檗碱损坏了细胞膜[33]，破坏了细胞膜的完整性，而细胞膜能够保障细胞生命活动正常进行，使胞内的蛋白外泄，因此导致试验组的蛋白质释放量增大。

图4 小檗碱对细菌细胞外蛋白质浓度的影响Fig.4 The effect of berberine on the concentration of bacteria extracellular protein

2.6 小檗碱对细菌细胞内蛋白质浓度的影响

由图5可知，沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞外蛋白质质量浓度分别减少0.045，0.013，0.0409 和0.038 mg/mL。加入1 MIC 小檗碱的试验组蛋白质释放量与未加入小檗碱的对照组相比均显著降低（P＜0.05），原因可能是小檗碱抑制了细菌胞内蛋白的表达，蛋白的合成受阻，造成蛋白含量减少，而蛋白质参与生物各项生命活动，从而干扰细菌的正常代谢活动。

图5 小檗碱对细菌细胞内蛋白质浓度的影响Fig.5 The effect of berberine on the protein concentration in bacterial cells

2.7 小檗碱对细菌总蛋白质浓度的影响

通过计算细菌细胞总蛋白浓度（细胞内外蛋白质浓度总和），来验证小檗碱对细菌中蛋白质合成总量的影响。由图6可知，加入1 MIC 小檗碱的试验组细胞外蛋白质浓度金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌4 种供试菌的细胞总蛋白质质量浓度分别减少0.0284，0.0117，0.0382 和0.009 mg/mL，加入1 MIC 小檗碱的试验组细菌总蛋白质浓度与未加入小檗碱的对照组相比均显著减少（P＜0.05），说明小檗碱可减少细菌蛋白的合成量，使细菌的蛋白质合成受到抑制，进而影响细菌的各项生命活动，达到抑菌效果。

图6 小檗碱对细菌细胞总蛋白质浓度的影响Fig.6 The effect of berberine on the bacterial protein concentration

2.8 小檗碱对菌体蛋白合成的影响

如图7所示，试验组与对照组的蛋白条带相比具有显著区别。总体而言，4 组对照组的条带数量明显多于试验组，且条带更清晰。试验组的金黄色葡萄球菌条带在44.3 ku 处的条带与对照组相比明显变浅，大肠杆菌在116，66.4 ku 与44.3 ku处的条带消失且条带数量均减少，沙门氏菌在44.3 与200 ku 之间的条带变浅，枯草芽孢杆菌在44.3 ku 附近处的条带变浅，较不明显。表明小檗碱抑制了4 种供试菌种细胞内蛋白的表达，细菌细胞内的蛋白质减少，与小檗碱对细菌细胞蛋白质合成的影响的测定结果是一致的。

图7 小檗碱对菌体蛋白合成的影响Fig.7 Effect of berberine on bacterial protein synthesis

3 结论

如今，绿色健康食品越来越受到消费者的关注，安全性更高的天然食品防腐剂的开发利用显得更加重要。细叶小檗果小檗碱作为一种天然抑菌物质，对食品中常见的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌均有抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制效果更好，DIZ 与MIC 的值分别为（11.6±0.11）mm 和2.40 mg/mL。紫外线照射对小檗碱的抑菌活力几乎没有影响，强酸、强碱及高温会破坏部分小檗碱的结构，使其抑菌活力降低，表明紫外线照射对小檗碱的稳定性基本没有影响，而在强酸、强碱及高温条件下稳定性较差。此外，小檗碱可使4 种供试菌细胞内的蛋白质外泄，导致细胞外的蛋白质浓度增大，同时也会抑制细胞内蛋白的表达，使细胞总蛋白浓度减少，从而发挥其抑菌作用，因此，细叶小檗果小檗碱具有开发成为天然食品防腐剂的潜力，此后应进行细胞毒性试验和食品应用中的研究，确定其安全性，为其在天然食品防腐剂中的开发应用以及进一步探究小檗碱与细菌中蛋白质的相互作用关系提供理论基础依据。