同位素稀释—超高效液相色谱—串联质谱法测定婴幼儿奶粉中水溶性维生素

黄水林 何 明

(深圳市深业航天食品与环境检测科技有限公司，广东 深圳 518040)

B族维生素是人体内一类重要的水溶性维生素，在人体代谢的甲基化、三羧酸循环等过程中，起着非常重要的作用，如果摄入不够或者过量均会导致机体内的代谢难以进行，从而产生疾病[1-3]。有研究[4]表明，高蛋氨酸、低叶酸和维生素B6、B12的饮食可能与netrin-1的表观遗传沉默导致的记忆丧失有关。而B族维生素在婴儿的正常发育中至关重要[5-6]，如果摄入不足，可能会对机体造成不可逆转的伤害[7]。

GB 10765—2010和GB 10767—2010对婴幼儿奶粉中允许添加的8种B族维生素给出了明确的限量。目前关于婴幼儿奶粉及配方食品中B组维生素的分析方法主要集中在光谱分析法[8-9]、色谱分析法[10]、色谱质谱分析法[11-13]和微生物法[14-16]。光谱分析法无分离步骤，每次只能测定一种目标物且受杂质影响较大。色谱分析法可同时检测多种目标物，但目标物数量太多，分离难度较大。微生物法步骤便捷，检测快速，但检测成本较高。质谱法则具有目标物选择性高，检出限低和多种化合物准确定性定量的优点，科研工作者也进行了相关研究，如陈美君等[12]建立了同时测定11种水溶性维生素的串联质谱法，但未使用内标物对结果进行校正；严华等[13]所建立的方法，虽然使用了内标进行校正，但测定10种水溶性维生素，需要使用两种离子化模式，并要切换流动相组成，分析时间较长。研究拟使用直接超声提取，等电点沉淀蛋白的前处理方法，建立一次进样同时测定婴幼儿配方奶粉中的10种水溶性维生素B的方法，为婴幼儿食品中多种维生素的分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

质谱仪：API4000Q TRAP型，美国AB SCIEX公司；

液相色谱系统：LC-30AD型，日本岛津公司；

超纯水系统：Milli-Q Advantage A10型，法国Merck Millipore公司；

高速冷冻离心机：1-14K型，德国Sigma公司；

涡旋混匀器：IKA MS3型，德国IKA公司。

1.2 试剂

标准品：泛酸(纯度≥95.8%)、烟酸(纯度≥98.5%)、烟酰胺(纯度≥98.0%)、叶酸(纯度≥91.3%)、吡哆醛(纯度≥98.0%)、吡哆醇(纯度≥98.5%)、吡哆胺(纯度≥98.2%)、硫胺素(纯度≥98.0%)、核黄素(纯度≥98.5%)、生物素(纯度≥99%)，德国Dr公司；

内标物：泛酸-D4(纯度≥98.0%)、烟酸-D4(纯度≥98.0%)、烟酰胺-D4(纯度≥98.0%)、叶酸-D4(纯度≥97.0%)、吡哆醛-D3(纯度≥98.5%)、吡哆醇-D3(纯度≥94.5%)、吡哆胺-D3(纯度≥98.0%)、硫胺素-13C3(纯度≥97.0%)、核黄素-13C4-15N2(纯度≥95.0%)、生物素-D4(纯度≥95.0%)，加拿大Research Chemical公司；

甲醇、乙酸铵：色谱纯，美国Fisher公司；

盐酸、氢氧化钠、氨水：分析纯，广州化学试剂厂；

实验用水：Milli-Q超纯水：Milli-Q Advantage A10型超纯水系统。

1.3 色谱条件优化

在相同的色谱条件下，对比Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)对多种水溶性维生素的分离效果，有机流动相为甲醇，无机流动相为10 mmol/L乙酸铵，设定有机相为A相，无机相为B相，进样体积10 μL；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；梯度洗脱程序：0～2 min，2% A；2～5 min，2%～35% A；5～7 min，35%～95% A；7～9 min，95% A；9～10 min，95%～2% A；10～15 min，2% A。

1.4 标准溶液配制

1.4.1 标准储备液 分别称取适量的维生素标准品及其同位素内标，称取适量的标准品至容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸定容，配制质量浓度为1 000 mg/L(折算标准品纯度)。其中叶酸使用0.5%氨水配制。

1.4.2 标准中间液 10种维生素分别取0.5 mL于10 mL容量瓶，用水定容，混成50 mg/L标准中间液。

1.4.3 内标中间液 取0.25 mL于10 mL容量瓶，用水定容，混成25 mg/L标准中间液。

1.4.4 标准工作曲线 分别准确移取2.0，10，20，50，100，200，500 μL的标准中间液于50 mL容量瓶中，加入100 μL的内标溶液，用水稀释中间液至各级质量浓度为2.0，10，20，50，100，200，500 μg/L，得到标准系列曲线，其中内标浓度均为50 μg/L。

1.5 质谱条件优化

在ESI离子源下，采用全扫描模式和MRM扫描模式，气帘气207 kPa；毛细管电压5 000 V；离子源温度550 ℃；雾化气(GAS1)345 kPa；加热辅助气(GAS2)345 kPa；碰撞气(CAD)中等；使用流动相混合的流动注射的方式将标准溶液直接注入质谱，通过全扫描确定[M+H]+准分子离子峰(m/z)，MRM扫描确定最优电压。于三重四极杆串联质谱中进行测定。对最佳超声时间和基质效应进行探讨，并通过不同水平进行加标回收试验，测定日内相对标准偏差。

1.6 样品前处理优化

称取2.5 g配方奶粉于50 mL塑料离心管，加入50 μL质量浓度为25 mg/L混合内标溶液，加入25 mL 40～50 ℃温水，使配方奶粉充分溶解，超声(5，10，15，20，25，30 min)，待样品冷却至室温后，用1 mol/L盐酸溶液调节pH至1.8，静置2 min，再用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.6。加盖后以10 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm水相滤膜，根据各个化合物含量差异再用水稀释一定的倍数，使含量在线性范围内，供UPLC-MS/MS测定。计算出水溶性维生素的回收率，确定最优超声时间。

1.7 基质效应探究

取空白原料基粉，按照优化后的前处理方法进行处理，得到基质液，用基质液配置标准系列曲线，同时配置相同浓度的溶剂曲线(曲线均不添加内标)，供仪器测定后于Excel软件拟合曲线方程。基质效应由基质曲线方程和溶剂曲线方程的斜率之比表示。

1.8 方法学验证

用纯水配制质量浓度为2.0～500.0 μg/L的标准曲线，其中含内标50 μg/L。在空白的基粉中添加低浓度的混合标准溶液，按优化后的前处理方法处理，并于仪器测定结果。以信噪比S/N=3和S/N=10分别测定方法检出限(LOD)和方法定量限(LOQ)。同时，对样品进行测定，并按照样品本底值附近的1，2，5倍水平进行加标回收试验(n=6)，测定所有水溶性维生素的含量，并计算出回收率和相对标准偏差。

1.9 样品测定

随机选取20个实验室的日常样品，用所建立的方法对多种水溶性维生素进行测定，判断结果与明示值之间的偏差。

1.10 数据处理

多种水溶性维生素按照1.5方法处理，使用三重四极杆串联质谱测定不同样品的峰面积，通过内标校正曲线进行定量计算，回收率及相对标准偏差数据于Excel 2007软件中计算分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

试验前期比较了Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色谱柱对多种目标物的峰型及分离度的效果。结果发现BEH C18柱分离度不及T3色谱柱，且C18柱分离硫胺素和核黄素容易峰展宽。因此选择Waters ACOUTITY HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)作为分离柱。同时，考虑到目标物的极性较大，因此选择了洗脱能力相对较弱的甲醇作为有机相，并且在水相中添加乙酸铵以增大流动相整体的离子强度，从而改善峰型，在此色谱柱及流动相条件下进一步优化梯度洗脱程序。最终10种水溶性维生素的MRM色谱图见图1。

2.2 质谱条件的确定

由于10种水溶性维生素均含有亲核基团，在电喷雾电离源的正离子模式下，可形成稳定的[M+H]+母离子，且响应较高。虽然部分化合物在负离子模式下也有响应，但为了方便测定，最终选择在正离子模式下测定。将标准溶液以流动注射的方式注入离子源，对准分子离子及其二级子离子进行扫描，每秒采集数最多的碎片作为定量峰，响应次之的作为定性峰。同时，由于不同的化合物，在同一离子化模式下，会具有各自不同的最优去簇电压(DP)，因此需要优化以获得较高的响应。另外不同的准分子离子在多反应监测下，进一步优化碰撞电压(CE)，使最终采集方法的各个二级子离子都达到最佳响应。具体的离子参数见表1。

图1 10种水溶性维生素的MRM色谱图Figure 1 MRM chromatograms of ten water-soluble vitamins

2.3 超声时间对外标回收率的影响

由于方法使用了内标物进行校正，所以最终回收率会较高。但为了保证较高的灵敏度，以及避免结果出现较大的偏差，需要针对外标物的实际回收率进行前处理条件的优化。为了避免基质效应带来的影响，试验前期先使用未添加10种维生素的乳粉基粉按1.4的前处理方式进行处理，同时测定本底值，所得基质液按照1.3的配制方法用以配制标准工作曲线，不添加内标。由于待测定维生素较多，因此，按照目标物的出峰时间，初步确认10种维生素的极性大小，选择不同极性的4种维生素(吡哆胺、烟酰胺、烟酸和核黄素)进行不同超声时间下的加标试验，对回收率进行考察。4种维生素在超声10 min时，回收率基本达到最大，此后变化不明显，可能是由于维生素极性均较大，在乳粉中添加后也未与基质形成稳定的结合态，但可能会在基质表面形成一定的物理吸附，当提取时间过短时，目标物未能与基质解离，并与水相形成氢键，所以回收率较低。最终，为了节省提取的时间，减少试验成本，选取10 min为最佳超声时间。详细结果见图2。虽然在不使用内标校正的情况下，10种维生素的回收率较高，但只是校正了基质效应的影响，而未对回收率进行校正，但使用内标定量，则可以在不配制基质曲线的情况下，同时校正基质效应和回收率，测定结果也更为准确。

2.4 基质效应

由于婴幼儿奶粉中含有较多的蛋白、氨基酸等水溶性杂质，在测定过程中，会对目标物的响应造成影响。一般可以通过净化或者色谱分离等手段进行除杂，但由于蛋白、氨基酸等物质含量要远大于目标物，因此一般的净化方法，基质剩余仍较多，而针对试验的前处理方法，由于维生素作为添加剂加入，为了简化试验，选用了直接超声提取，等电点沉淀蛋白的处理方法。这样导致了溶液中的杂质较多，因此试验也通过优化液相梯度洗脱程序，使目标物与基质尽可能分离，从而减少基质对目标物响应的影响。为进一步考察基质效应，使用乳粉基粉配制的标准曲线斜率K1与纯水配制曲线的斜率K2作比较，结果发现，10种维生素的曲线斜率比值ME(Matrix effect)为15.8%～184.0%，抑制和增强效果均超过20%，说明基质效应明显，但由于实际定量的标准曲线是含同位素内标曲线，可同时对回收率和基质效应进行校正，因此尽管基质效应虽然明显，但对方法整体灵敏度影响不大的情况下，最终使用纯水配制的内标曲线进行定量。

表1 10种维生素的质谱分析参数†Table 1 MS/MS parameters of ten water-soluble vitamins

图2 超声时间对回收率的影响Figure 2 Effect of ultrasonic time on recovery (n=6)

2.5 线性关系、检出限和定量限

将标准系列曲线按优化后的UPLC-MS/MS条件进行测定。10种维生素均以外标物浓度与内标物浓度比值为横坐标，定量离子峰面积比值为纵坐标绘制校准曲线方程，见表2。10种维生素曲线方程的相关系数R2均大于0.998 7，相关系数较高，说明外标物在曲线浓度范围内呈良好的线性。通过对空白基粉的低浓度加标，以信噪比S/N=3和S/N=10分别计算方法检出限为10～50 μg/kg，方法定量限为30～150 μg/kg，详细结果见表2。因为婴幼儿奶粉中，会额外添加水溶性维生素，而方法的定量限远低于一般的样品含量，同时使用内标校准的情况下，该标准曲线可准确定量。

2.6 精密度、回收率及重复性

为了验证方法的回收率，选择已添加维生素的阳性婴幼儿配方奶粉为样品，日内平均测定6次，取平均值为本底值。以本底值的3个不同倍数水平进行标准添加回收，同一水平的样品于24 h内做6次平行试验，并根据回收率结果计算相对标准偏差。结果显示(表3)，平均回收率范围在85.7%～102.0%，回收率的相对标准偏差值RSDs在1.11%～5.69%。由于受到内标物的校正，大大降低了随机误差，所以结果的相对标准偏差值较低。同时，回收率结果中出现回收率偏差较大的情况，可能是由于样品中结合态维生素的提取存在一定的偏差，从而影响了回收率结果。综合考虑，回收率及相对标准偏差数据均能满足一般样品含量的分析测定要求，因此试验不对样品进行酶解处理。

表2 10种维生素的校准曲线参数、检出限及定量限Table 2 The parameters of calibration curve and limits of detection and quantitation for ten water-soluble vitamins

表3 10种维生素的方法学结果Table 3 Methodological results of ten water-soluble vitamins (n=6)

2.7 方法的实际应用

为了验证方法的实用性，随机选取20个实验室的日常婴幼儿配方奶粉进行测定，测定结果显示，20个样品中，10种维生素的含量均在明示值的85.6%～113.0%，最大偏差约为15%。

3 结论

试验对婴幼儿配方奶粉中的10种水溶性维生素进行直接超声提取，优化了超声提取时间；调节pH至等电点，蛋白质沉淀效果良好；优化的色谱条件下，10种维生素分离效果好，峰型对称，且通过与基质分离，一定程度上降低了基质效应；通过流动注射的方式，对10种维生素的各个离子对响应进行了优化，方法的检出限和定量限可满足婴幼儿奶粉中水溶性维生素的含量测定要求；回收率及其相对标准偏差结果表明，使用同位素内标校正后，方法的这两项数据都能满足测定要求。