病原菌感染斑马鱼胚胎差异表达基因的生物信息学分析研究

迟 彦， 彭程程， 郝予嘉， 郭瀚泽， 朱莹莹， 李佳芮

(1.辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081；2.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622)

天然免疫又称固有免疫，是物种在长期进化过程中逐渐形成的抵御病原菌感染的第一道防线，包括组织屏障、固有免疫细胞和固有免疫分子，它在抵御外来微生物侵扰和保护机体等方面发挥着非常重要的作用[1].天然免疫系统可以通过一系列的受体识别并监测病原菌的入侵，这一类受体被称作模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRS)，包括Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、RIG-1样受体(RIG-I-like receptors，RLRs)、NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)和C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLRs)等亚家族，它们可以单独或者共同协作发挥天然免疫功能.这些模式识别受体主要识别被称为病原相关模式分子(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的病原菌微生物进化保守结构[2].参与天然免疫的模式识别受体识别病原相关模式分子后，激活细胞内信号通路[3]启动促炎和抗菌反应,从而调节基因表达，最终启动免疫应答.

斑马鱼的天然免疫系统在鱼卵受精1～4 d就已发育成熟，而适应性免疫系统则在受精后的4～6周后才能发育成熟[4-5]， 即斑马鱼的胚胎发育过程中存在一个仅具有天然免疫的特殊时期[6].以斑马鱼为实验材料可以排除适应性免疫的干扰，所以其在免疫学、发育生物学和病理学等方面的研究中具有非常重要的作用，成为研究人类相关疾病和在活体内进行早期药物筛选、研究病原菌与宿主之间的相互作用及其免疫应答机制的模式生物.

本研究以斑马鱼胚胎感染迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的GEO表达谱数据库(GSE35474)为分析对象，利用生物信息学手段分别筛选了两种菌感染8 h后的差异表达基因，并通过GO功能富集和KEGG信号通路分析，对差异表达基因进行了功能注释，获得其相关的信号通路，并构建了差异表达基因蛋白质互作网络(Protein protein interaction network，PPINetwork)，筛选了关键hub基因，为研究斑马鱼和病原菌之间的相互作用分子机制提供理论依据.

1 资料与方法

1.1 资 料

以斑马鱼和天然免疫为关键词，在NCBI(National center of biotechnology information,NCBI)GEO(GeneExpression omnibus，GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中进行搜索，选取斑马鱼分别受迟钝爱德华氏菌和鼠伤寒沙门氏菌感染8 h之后的表达谱数据库(GSE35474)进行后续生物信息学分析.

1.2 方 法

1.2.1 差异表达基因的获取

将GEO数据库中基因探针注释为基因名后，利用R语言的“limma”包，对表达矩阵进行归一化处理，以|lb FC|>0.2和校准后P<0.05为筛选条件，分别获取迟钝爱德华氏菌和鼠伤寒沙门氏菌感染斑马鱼胚胎的差异表达基因，利用TBtools软件对上述两组差异表达基因取交集，用于后续分析.

1.2.2 GO功能富集分析

利用DAVID 6.8在线工具(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)进行GO功能富集分析，将所得差异表达基因导入David网站，得出差异表达基因GO功能富集结果，该结果由生物学过程(Biological process，BP)、细胞组分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function,MF)3个方面组成.以P<0.05为筛选条件得到富集结果，利用R语言制图.

1.2.3 KEGG信号通路分析

将差异表达基因导入DAVID 6.8在线分析网站(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)进行KEGG信号通路分析，将下载分析结果导出后，以P<0.05为筛选条件得到富集结果，利用R语言制图.

1.2.4 构建差异表达基因间蛋白质-蛋白质相互作用关系图

利用STRING网站(https://string-db.org/)分析所得差异表达基因间蛋白质的互相作用关系，在线构建蛋白质相互作用网络.

1.2.5 筛选关键基因

利用Cytoscape 3.8.0软件的cytoHubba插件，采用Degree、EPC、MNChe和Closeness 4种算法筛选关键hub基因.

2 结 果

2.1 差异表达基因的筛选

通过R语言“limma”包筛选得到鼠伤寒沙门氏菌感染斑马鱼胚胎差异表达基因2 366个，其中,上调表达基因1 141个，下调表达基因1 225个(图1A).筛选得到迟钝爱德华氏菌感染斑马鱼胚胎差异表达基因1 012个，其中,上调表达基因413个，下调表达基因599个(图1B).对上述两组差异表达基因取交集，最终得到127个共同差异表达的基因.

图1A 鼠伤寒沙门氏菌感染斑马鱼胚胎差异表达基因的火山图图1B 迟钝爱德华氏菌感染斑马鱼胚胎差异表达基因的火山图Fig.1A Volcano map of differential expressed genes in zebrafish embryos infected with Salmonella typhimuriumFig.1B Volcano map of differential expressed genes in zebrafish embryos infected with Edwardsiella tarda

2.2 GO基因功能富集分析

将127个差异表达基因导入DAVID 6.8数据库中进行分析，图2显示，127个差异表达基因一共参与38个生物学过程，6种细胞组成，11种分子功能.在生物学过程方面，19个基因参与了转录调控、DNA模板化过程，11个基因参与炎症反应过程，9个基因参与天然免疫反应过程，9个基因参与了对细菌的防御反应.表1显示的是以P<0.05筛选的排名前10的生物学过程.在细胞组成方面(表2)，25个基因参与组成细胞外区域和空间，21个基因参与组成细胞质，3个基因参与组成蛋白酶体复合物.在分子功能方面，差异表达基因主要富集在转录因子活性、序列特异性DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性等功能，表3显示的是以P<0.05筛选的排名前10的分子功能.

图2 GO 基因功能富集分析Fig.2 GO gene functional enrichment analysis

表1 差异表达基因生物学过程分析

表2 差异表达基因细胞组成分析

表3 差异表达基因分子功能分析

2.3 KEGG信号通路分析

将127个差异表达基因导入DAVID 6.7数据库中进行分析，以P<0.05为筛选标准，差异表达基因富集所在的信号通路排名前10的有Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通道、MAPK信号通路、RIG-I样信号通路、细胞凋亡信号通路、单纯疱疹病毒感染信号通路等(图3，表4).

图3 差异表达基因KEGG信号通路分析结果Fig.3 Results of KEGG signaling pathway analysis of differential expressed genes

表4 差异表达基因KEGG信号通路分析结果

2.4 差异表达基因的蛋白质互作关系

将127个差异表达基因导入STRING在线网站进行差异表达基因的蛋白质与蛋白质相互作用分析，图4显示有106个节点，303个边，平均节点度是5.72，平均局部聚类系数是0.363.

图4 差异表达基因的蛋白-蛋白相关作用图Fig.4 Protein-protein interactions network of differential expressed genes

2.5 关键hub基因筛选

利用Cytoscape 3.8.0软件的cytoHubba插件，采用4种算法分别得到hub基因，最后将4种算法所得到的hub基因取交集，得到8个关键基因(图5)，它们是TNFα、TNFβ、SOCS、IRF1、STAT3、MMP9、FOS、NF-κB.

图5 4种算法的hub基因韦恩图Fig.5 Hub gene Venn diagram of the four algorithms

3 Hub基因讨论

3.1 TNF

TNF(Tumor necrosis factor，TNF)基因编码肿瘤坏死因子.TNF家族主要包括TNFα和TNFβ.TNF可以通过结合肿瘤坏死因子受体发挥功能，参与多种生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢和凝血，并与多种疾病有关，包括自身免疫性疾病、胰岛素抵抗和癌症等.Gali等以酵母β-葡聚糖作为免疫刺激剂刺激斑马鱼时发现，酵母β-葡聚糖使斑马鱼成纤维细胞高表达TNFα、IL1β、IL6、IL8、IL10等基因，即通过增强细胞因子的基因表达从而大大增加斑马鱼对鲤鱼病毒感染的存活率[7].Wu等用创伤弧菌刺激3种转基因斑马鱼品系，其中，转罗非鱼GRN-41肽的转基因斑马鱼提高了TNFβ、IL1、IL8、IL6和HAMP的表达，进而提高了存活率[8].Li等用3种嗜球果伞素(吡咯菌酯，三氟木黄酮和微木黄酮)刺激斑马鱼胚胎，结果斑马鱼胚胎均可产生免疫反应，上调了TNFα、IL1β和IL8基因的表达[9].这些结果均提示TNF基因是与天然免疫相关的主要基因之一，其上调表达可启动天然免疫反应.

3.2 SOCS

SOCS(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)编码细胞因子抑制剂家族成员，该基因的表达由多种细胞因子，如IL6、 IL10、IFNγ所诱导，其编码的蛋白可以结合JAK2激酶进而抑制JAK2的活性.Xiao等发现鲤鱼被SVCV(鲤鱼春季血症病毒)感染后，其肠、胸腺、脾脏、头肾和肾脏组织中的SOCS3基因呈时间依赖性显著上调，表明在病毒诱导的先天免疫应答的调节中SOCS3发挥积极作用，在病毒刺激下可以防止某些细胞因子的过度反应[10].Li等通过对太平洋牡蛎基因组的搜索和分析，确定了CgSOCS2、CgSOCS5和CgSOCS7三个SOCS基因，发现病原相关模式分子可以不同程度地诱导血细胞中CgSOCS(Crassostreagigassuppressor of cytokine signaling，CgSOCS)的表达.此外，双荧光素酶报告基因分析结果显示，CgSOCS2和CgSOCS7的过度表达可以激活NF-κB报告基因，这些结果表明CgSOCS可能在太平洋牡蛎的先天免疫应答中起重要作用[11].Zhang等用细菌病原体感染大菱鲆，发现SmSOCS3(Scophthalmus maximus suppressor of cytokine signaling 3，SmSOCS3)在大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏和鳃中显著表达.在头肾巨噬细胞中，SmSOCS3的过表达表现为抑制TNFα和IL1β的转录，显著降低了NO的产生和杀菌活性[12].

3.3 MMP9

MMP9(Matrix metalloproteinase 9，MMP9)是一种基质金属蛋白酶，分泌时为无活性的前体蛋白，当被细胞外蛋白酶切割时会被激活，该蛋白酶在降解Ⅳ型和Ⅴ型胶原以及细胞外基质的局部蛋白水解、白细胞迁移中发挥作用.Soest等将爱德华氏菌静脉注射斑马鱼胚胎，转录组和定量RT-PCR结果显示斑马鱼胚胎表现出强烈的炎症反应，IL1β和MMP9在全部胚胎中被诱导表达[13].Wang等利用爱德华氏菌浸没感染斑马鱼幼虫，发现炎性细胞因子TNFα、IL1β和MMP9等显著上调[14].Shan等发现单核细胞增生性李斯特菌浸入斑马鱼中不会引起致死性，但会诱导一些免疫反应基因的表达，其中,MMP9表达量显著上调[15].

3.4 IRF1

IRF1(Interferon regulation factor 1，IRF1)是干扰素调节因子(IRFs)家族一员，通过与启动子中的干扰素刺激反应元件相结合，激活特定的靶基因而在病毒和细菌应答、细胞增殖、凋亡、DNA损伤修复以及免疫反应中发挥作用.

Ruan等在斑马鱼中发现IRF1B基因与哺乳动物IRF1基因同源[16].Fan等研究结果显示当斑马鱼髓细胞内IRFγ信号通路异常激活时，STAT1A和IRF1B基因表达会明显上调，影响了中性粒细胞发育，对天然免疫反应产生影响[17].Liu等以石斑鱼为实验对象发现DDX41(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)-box Polypeptide 41)的同源基因EcDDX41(Epinepheluscoioides DDX41，EcDDX41)过表达导致了IRF1的表达上调[18].Feng等发现斑马鱼IRF1在斑马鱼的头肾和脾脏等免疫组织中含量最丰富，是病毒感染后诱导作用最强的基因之一.在利用鲤鱼病毒(SVCV)感染鲤鱼上皮瘤细胞后，发现斑马鱼DrIRF1过表达，能够诱导IFN和IFN刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)的表达，从而保护鲤鱼上皮瘤细胞免受SVCV的侵袭，证明了DrIRF1是鱼类抗病毒反应的正调节因子[19].上述实验结果均可证明IRF1在天然免疫中起到重要作用.

3.5 STAT3

STAT3是信号转导与转录活化因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT) 蛋白质家族的成员.STAT家族成员被受体相关激酶磷酸化，形成同源或异源二聚体移位入细胞核，作为转录激活因子介导应答各种细胞因子和生长因子,包括干扰素、EGF、IL5、IL6、HGF、LIF和BMP 2等的细胞刺激的基因表达，在细胞生长和凋亡过程中发挥重要作用.Liang等从日本鳗鲡中分离到两个STAT家族基因(STAT1a和STAT2)，分别命名为AjSTAT1a和AjSTAT2.研究发现在感染迟钝爱德华氏菌的组织中，AjSTAT1a和AjSTAT2基因表达增加，表明AjSTAT1a和AjSTAT2可能是调节宿主天然免疫防御病原体的关键[20].Xiong等在研究氧化石墨烯纳米颗粒(Graphene oxide，GO)对斑马鱼肝脏毒性的影响实验中发现，GO诱导成体斑马鱼肝脏NF-κBP65、JAK2、STAT3等基因表达显著上调，天然免疫功能被激活，表明这些基因在调节天然免疫功能中起到重要作用[21].STAT3在免疫应答、信号转导和转录调控中起到关键作用，是机体抵御病毒感染的重要靶基因.

3.6 NF-κB

NF-κB(Nuclear factor kappa B subunit，NF-κB)是几乎所有细胞类型中都存在的多效转录因子，为一系列由生物学过程,如炎症、免疫、分化、细胞生长、肿瘤发生以及凋亡等介导的信号转导事件的终点.NF-κB由RELA/P65、RELB、NF-κB1/P105、NF-κB1/P50、REL和NF-κB2/P52组成同型或异型二聚体复合物.NF-κB复合物在细胞质中与I-kappa-B结合，为无活性状态.当细胞转导导致I-kappa-B磷酸化后，NF-κB则释放入核，同DNA相应元件结合，调节基因表达，参与免疫、炎症等反应.Oyarbide等利用鳗弧菌感染斑马鱼，通过基因表达分析，发现在感染后最初3 h内，许多先天免疫基因,如NF-κB、IL1β、TLR4和TRF的表达水平被抑制，由此表明，斑马鱼的免疫系统发生了变化[22].Goody等利用人甲型流感病毒(Human influenza A virus，IAV)感染杜氏肌营养不良的斑马鱼突变体，发现突变体斑马鱼肌肉中NF-κB信号被激活，斑马鱼的先天性免疫反应被激活，结果造成了更严重的肌肉损伤[23].

Zhang等利用副溶血性弧菌感染斑马鱼幼虫，发现TNF信号通路、NF-κB信号通路和JAK-STAT信号通路有关的基因的表达均发生了改变[24].上述结果表明，NF-κB参与了斑马鱼的先天免疫反应.

3.7 FOS

FOS(Fos proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit)基因家族由4个成员组成：FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2.这些基因编码亮氨酸拉链蛋白，能够与Jun(Jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit)家族的蛋白质结合形成二聚体，从而形成转录因子复合物AP-1(Activator protein-1).因此，FOS蛋白被认为是细胞增殖、分化和转化的调节因子.Yang等在利用从鼠伤寒沙门氏菌中提纯的Pam3CSK4刺激斑马鱼胚胎，在qPCR分析中发现FOSB发生了2倍以上的变化，说明FOSB可能在斑马鱼胚胎的天然免疫过程在起到一定作用[25].Ellison等发现在病原菌攻击下，低密度饲养的鲑鱼表现出炎性白细胞介素和淋巴细胞相关基因的表达增加，而高密度饲养的鲑鱼表现出与应激相关的标志物，如c-FOS和HSP70表达上调，说明c-FOS可能在调节天然免疫基因表达方面起作用[26].附表为文中提到基因的缩略词表.

附表 缩略词表