泽漆抗肿瘤抗炎作用及机制研究

高 帆 牛玉季 张亚茹 李雯雯 郭丽娟 王俊茹 杜钢军

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封475004

2019 年国家癌症中心的报道，肝癌已成为我国发病率第四，致死率第二的恶性肿瘤疾病。在世界范围内，每年原发性肝癌新增病例高达84 万，死亡病例高达78 万，肝癌已经成为威胁人类健康的危险疾病［1］。肝癌具有隐匿性强、恶性程度高、发病率与死亡率高、发病前期难以察觉、易复发的特点，很多患者在确诊时已经错过手术根除的黄金时间［2］。目前对肝癌的治疗，主要包括手术，放疗和化疗等。手术风险大，加重患者死亡的风险。放射治疗和化疗手段副作用多，预后差。目前的治疗手段，存在的毒副作用和术后并发症，降低了患者的生活质量［3］。中医对肝癌的治疗具有独特的优势，中医针对患者的中医证候，采用辨证施治的方法，可以全面调理机体的生理状况、改善患者的病理状况。研究［4⁃5］表明，在原发性肝癌的治疗中，中药不仅可以减缓癌症的发病以及转移，还可以减轻化疗给患者带来的伤害，缓解患者的疼痛、失眠、疲倦等症状，在提高肝癌治疗的效果的基础上，显著地提高患者的生存质量，也调动了患者配合治疗的积极性。

中药泽漆是大戟科植物Euphorbia helioscopiaL.的全草，性微寒，味辛、苦，入肺、大肠、小肠经，记载有小毒，能够利尿消肿，化痰散结［6］。现代药理学研究［7⁃9］表明，泽漆具有抗肿瘤、退热消炎、抑菌、平喘等效果，在临床上可用于治疗水肿、肿瘤等疾病。本研究通过建立H22荷瘤小鼠肝癌肿瘤模型和二甲苯诱导的耳肿胀炎症模型，评价泽漆的抗肿瘤与抗炎作用，并通过网络药理学的方法分析其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 药材及水煎液

泽漆购于开封市天济堂药房，经河南大学生药教研室鉴定为大戟科泽漆（Euphorbia helioscopiaL.）的干燥全草。

制备泽漆水煎液：精密称取干燥泽漆全草100 g，加水900 mL 蒸馏水浸泡45 min，然后武火煮至沸腾后转文火将药液浓缩至300 mL 滤出药汤。上述步骤反复煎煮两次后合并3 次的水煎液。加热浓缩合并后的水煎液至200 mL，得泽漆水煎液。每毫升药汤含有泽漆生药量0.5 g，按给药所需剂量分装后置于-80 ℃环境中保存。

1.2 实验动物

SPF 级昆明种小鼠，雌性，6～8 周龄，体重24～28 g，由河南省医学实验动物中心提供，小鼠的许可证号SCXK（豫）2015⁃0002，所有动物程序均经河南大学动物实验伦理委员会（许可号：HUSAM 2016⁃288）批准，饲养于河南大学实验动物中心，动物饲料合格证号：No.41000100003159。实验遵循3R 原则，给予实验动物应有的人道关怀，保证实验动物应有的福利。实验期间，小鼠自由饮水进食，自然光照，室温24～26 ℃。

1.3 细胞株

H22肝癌细胞，由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。

1.4 实验仪器

FA1004B 型电子天平（购自广州市典锐化玻实验仪器有限公司）；EM⁃KC150 数显游标卡尺（购自河东区星光扳钳工具厂）；OptiMairTM垂直流超净工作台（购自新加坡艺思高科技有限公司）；CO2细胞培养箱（购自SL 公司）；微量移液器（购自上海佳安分析仪器厂）；BCD⁃539WT 低温冰箱（购自海尔集团）等。

1.5 实验试剂

生理盐水（氯化钠AR，购于天津市德恩化学试剂有限公司，批号：20191005）、二甲苯（二甲苯AR，购于天津市富晨化学试剂厂，批号：20150812）、印度墨汁、0.1% NaHCO3溶液（碳酸氢钠AR，购于天津市德恩化学试剂有限公司，批号：20201221）。

2 实验方法

2.1 小鼠分组

40 只雌性昆明小鼠，随机分为5 组，每组8 只小鼠。分别为正常组、肿瘤模型组、肿瘤模型组+给药组、炎症模型组、炎症模型组+给药组。

2.2 建立H22肝癌细胞小鼠荷瘤模型

复苏H22肝癌细胞，随机选取3 只，6～8 周龄的雌性，健康昆明小鼠，腹腔接种H22肝癌细胞0.2 mL／只。7～9 d 后处死小鼠，将小鼠浸泡于75%酒精中10 min。取出小鼠，在无菌环境中抽取腹水置于离心管中，离心后弃上清液，用红细胞裂解液重悬细胞后静置5 min，再离心弃上清液，去除红细胞。0.9%的生理盐水重悬H22肝癌细胞，并稀释至1×107个／mL 细胞液。在无菌环境下，每只小鼠在右下前肢与后肢之间的皮下接种0.2 mL 的细胞液［10］。

2.3 给药

小鼠接种后次日，给药组小鼠每天按体重0.2 mL／10 g，灌胃给药泽漆水煎液，模型组灌胃等量的生理盐水，作为对照。

2.4 抗肿瘤检测指标

每隔两天，测量一次小鼠体重。待肿瘤大小生长至可以用手触摸到时，每天开始测量肿瘤长径和短径。当模型组小鼠的肿瘤平均直径大于25 mm时，终止给药，并处死小鼠，剥离肿瘤以及脾脏，并称重记录，记录小鼠肿瘤体积并计算肿瘤抑瘤率。瘤体积计算公式＝（长径×短径2）／2（mm3）；肿瘤抑瘤率＝［（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）／模型组平均瘤重］× 100%［11］。

2.5 二甲苯诱导小鼠耳肿胀的抗炎实验

实验结束当天，小鼠给药30 min 后，将40 μL二甲苯均匀涂抹于模型组小鼠和给药组小鼠的右耳表皮。半小时后，采用颈椎脱臼处死小鼠，剪下同一只小鼠的双耳，用打孔器（直径8 mm）在双耳的同一位置打耳片，用分析天平分别称重两片耳片，两耳片重量差即耳肿胀度，计算肿胀抑制率。肿胀抑制率＝［（模型组耳平均肿胀度-给药组耳平均肿胀度）／模型组耳平均肿胀度］×100%。

2.6 基于GraphPad prism 8 统计学分析

利用GraphPad prism 8 软件对实验结果进行处理分析，实验结果以表示，采用t检验和单因素方差分析，如果P＜0.05，则结果具有统计学意义。

2.7 网络药理学分析

按网络药理学验证流程图步骤，见图1。分别对泽漆抗肿瘤作用和抗炎作用进行网络药理学分析。分析泽漆抗肿瘤和抗炎的可能的作用机制，筛选出核心靶点，并进行生物过程和信号通路富集分析。

图1 网络药理学验证流程

3 结果

3.1 泽漆能够抑制H22荷瘤小鼠肿瘤增长

小鼠接种H22肝癌细胞后，于第6 天长出肿瘤，随后肿瘤迅速生长，小鼠体重也随之快速增长。与模型组相比，给药组小鼠肿瘤和体重增长较为缓慢，见图2、图3，肿瘤抑制率为42.31%（P＜0.05），见表1。

图2 小鼠体重变化

图3 小鼠瘤体积变化

表1 泽漆对H22荷瘤的抑制作用（）

表1 泽漆对H22荷瘤的抑制作用（）

*相较模型组，P＜0.05。

3.2 泽漆能够抑制二甲苯诱导的耳肿胀

与模型组相比，泽漆可显著抑制二甲苯诱导的耳肿胀（P＜0.01），见图4，肿胀抑制率为42.56%，见表2。

图4 小鼠耳肿胀比较

表2 耳肿胀抑制率（）

表2 耳肿胀抑制率（）

*相较模型组，P＜0.01。

3.3 泽漆抗肿瘤抗炎相关的靶点和信号通路

在TCMSP 数据库以及上海有机化学数据库，搜集得到泽漆的17 种主要化学成分，分别是表泽漆萜B（epieuphoscopinB）、泽漆双环氧萜C（euphohelinC）、泽漆环氧萜（euphohelionone）、大戟苷F（euphor⁃ninF）、泽漆萜B（euphoscopinB）、泽漆萜D（eu⁃phoscopinD）、泽漆萜E（euphoscopinE）、泽漆内脂B（helioscopinolideB）、泽漆内脂 C（helioscopinolideC）、泽漆新鞣质（7⁃Angelyl⁃9⁃echimidinylheliotri⁃dine）、樱花苷［（2R）⁃5⁃hydroxy⁃2⁃（4⁃hydroxyphenyl）⁃7⁃methoxychroman⁃4⁃one）］、γ⁃谷甾醇（poriferast⁃5⁃en⁃3beta⁃ol）、β⁃谷甾醇（beta⁃sitosterol）、山奈酚（kaempferol）、芦丁（rutin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）。于TCMSP 数据库和Swiss Target Prediction 数据库收集得到泽漆的活性成分靶点共329 个。

在Genecards 数据库和OMIM 数据库以“liver cancer”为关键词搜索肝癌相关的靶点信息，共得到16 490个疾病靶点。使用在线韦恩图取泽漆活性成分靶点与肝癌疾病靶点的交集，并删去成分靶点与肝癌治疗无关的活性成分，得到泽漆治疗肝癌的预测靶点共318 个，有效成分14 个。将有效成分与预测靶点信息导入Sytoscape3.8.0 软件，绘制C⁃T 网络图，见图5。图中红色节点为有效成分，绿色节点为多个有效成分作用的靶点（度值大于或等于2），蓝色部分为单个有效成分作用的靶点（度值等于1）。整个网络图共有133 个节点和318 条边，其中多成分作用靶点共34 个，单成分作用靶点共83 个。然后将疾病治疗靶点输入String 的多蛋白查询栏后，得到蛋白相互作用网络图，利用插件CytoNCA 进行分析。网络图中各节点的点度中心性、中介中心性、接近中心性，分析三者取前十个节点（点度中心性大于27、中介中心性不低于300、接近中心性大于0.25）作为核心靶点，筛选度值大于或等于10 小于或等于25 的节点作为中心节点，度值小于10 的节点为普通节点，见图6。PPI 网络图中共有110 个节点和535 条边，其中红色部分为核心靶点共10 个，分别为JUN、TP53、MAPK1、IL6、MAPK8、VEGFA、TNF、EGF、MAPK3、APP；绿色部分为中心节点共37个；黄色为普通靶点共70 个。

图5 泽漆抗癌的有效成分-预测靶点网络图

图6 泽漆抗癌的蛋白质相互作用网络图

在Genecards 数据库和OMIM 数据库以“Inflam⁃mation”为关键词搜索炎症相关的靶点信息，共得到10 272个相关靶点。使用在线韦恩图取泽漆活性成分靶点与炎症靶点的交集，并删去成分靶点与肝癌治疗无关的活性成分，得到泽漆治疗肝癌的预测靶点共313 个，有效成分15 个。将有效成分与预测靶点信息导入Sytoscape 3.8.0 软件，绘制C⁃T 网络图，见图7。图中红色节点为有效成分，蓝色节点为有效成分作用的靶点，整个网络图共有129 个节点和312 条边。然后将疾病治疗靶点输入String 的多蛋白查询栏后，得到蛋白相互作用网络图，利用插件CytoNCA 进行分析。网络图中各节点的点度中心性、中介中心性、接近中心性，分析三者取前十个节点（点度中心性大于25、中介中心性不低于300、接近中心性大于0.2）作为核心靶点，筛选度值大于8小于或等于25 的节点作为中心节点，度值小于或等于8 的节点为普通节点，见图8。PPI 网络图中共有106 个节点和525 条边，其中蓝色部分为核心靶点共10 个，分别为JUN、TP53、MAPK1、IL6、MAPK8、VEGFA、TNF、EGF、MAPK3、APP；黄色部分为中心节点共35 个；紫色为普通靶点共59 个。

图7 泽漆抗炎的有效成分-预测靶点网络图

图8 泽漆抗炎的蛋白质相互作用网络图

由上述步骤可知，泽漆抗肿瘤的核心靶点与泽漆抗炎的核心靶点一致，将泽漆抗肿瘤抗炎的10 个核心靶点名输入David 数据在线分析平台，通过该平台进行GO 分析中生物学进程分析以及KEGG 通路分析。GO 分析的生物学进程项目中共筛选得出34 条分析结果（P＜0.05，count≥3），分析结果显示，按count 降序排列，排行前5 个生物学进程分别为“转录阳性调控” “RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控”“ERK1 和ERK2 级联阳性调节”“基因表达的正向调控”“序列特异性DNA 结合转录因子活性的调控”。在KEGG 富集信号通路分析中，共筛选出27 条信号通路（P＜0.05，count≥5），按count 降序排列，前五个分别是“癌症相关通路”“乙型肝炎通路”“MAPK 信号通路”“胰腺癌通路”“百日咳通路”。通过Omicshare 在线绘图平台将GO 分析结果的前25 项和KEGG 通路富集27 项结果可视化，做图类型选择高级气泡图，见图9、图10。使用Cytoscape软件中的Merge 功能构建泽漆有效成分-蛋白靶点-细胞信号通路网络图，将泽漆有效成分与靶点及通路间的关系可视化，见图11。图中共150 个节点和170 条边，其中黄色的节点是药物的核心化学成分，蓝色的节点是泽漆的核心靶点，白色的节点是泽漆的核心靶点参与的通路。

图9 泽漆抗癌抗炎的GO 分析结果气泡图

图10 泽漆抗癌抗炎的KEGG 通路富集分析结果气泡图

图11 泽漆抗癌抗炎的成分⁃核心靶点⁃通路网络图

4 讨论

目前，肝癌的治疗手段存在有许多缺陷，比如不良反应多且严重，患者耐受性差等。传统中医药在治疗肿瘤方面具有不良反应轻，药效显著，能够显著提高患者生存期等优点。中医药治疗以扶正驱邪为主，不仅提高了患者的生存质量、改善了患者预后，还在提高患者生存率方面具有显著优势［12］。相对西药而言，中药具有多成分、多靶点的优势，其化学成分可以参与多个生物学进程影响机体的生理状况［13］。研究［14］表明，泽漆具有治疗癌症和抑制炎症的功效，并被应用于胰腺癌以及炎症的治疗。本研究通过建立H22荷瘤小鼠肝癌肿瘤模型，评价泽漆对肿瘤生长的抑制作用；建立二甲苯诱导的耳肿胀炎症模型，评价泽漆对荷瘤小鼠炎症的影响。本研究结果表明，与肿瘤模型组小鼠相比，泽漆给药组能够显著抑制小鼠的肿瘤体积生长，肿瘤抑瘤率为42.31%（P＜0.05），同时，与炎症模型组小鼠相比，泽漆给药组能够显著抑制二甲苯诱导炎症反应（P＜0.01）。

本研究通过网络药理学的方法，分析泽漆多成分、多靶点治疗肝癌的可能的机制。通过筛选，找到泽漆抗炎抗肿瘤的10 个核心靶点，分别为JUN、TP53、MAPK1、IL6、MAPK8、VEGFA、TNF、EGF、MAPK3、APP。泽漆的核心靶点中TP53 基因参与DNA 损伤修复，且TP53 的错义突变会影响患者的生存率。研究［15］表明，TP53 基因错义的患者对普钠替尼等药物具有耐药性，影响患者预后。IL⁃6 是一种急性反应期的重要媒介，IL⁃6 可以促进PGE2的合成调节体温，而在肌肉和脂肪组织中IL⁃6 会影响能量流动，从而导致体温升高。IL⁃6 的表达失调与许多疾病有关，在炎症反应的发生与肿瘤形成的过程中IL⁃6 会快速生成，并且外周血中的VEGFA，可作为肺癌转移的观测指标［16］。EGF 作为内皮生长因子，可以刺激细胞进行有丝分裂，因而可以促进细胞增殖并加速创伤愈合，EGF 参与的部分信号通路可以刺激癌细胞增殖［17］。TNF 具有强烈的细胞杀伤能力，可以有效杀伤癌细胞，抑制癌细胞的生长，TNF 水平降低与机体抗癌免疫力降低有直接关系，TNF 可以在肿瘤组织中诱导抑癌炎症环境，抑制癌细胞的分裂增殖以及侵袭转移能力［18］。MAPK级联是细胞内广泛存在的一类丝／苏氨酸蛋白激酶超家族，在各肿瘤细胞的发生、侵袭、转移和耐药过程中发挥了不同调控作用。p38MAPK 信号通路可以通过泛素化细胞周期蛋白D1，从而抑制肺癌细胞的增殖［19］。JNK 和p38MAPK 信号通路共同参与了由ROS 介导的伊立替康诱导的胃癌细胞的自噬凋亡。MAPK／p38 信号通路的激活与乳腺癌细胞EMT 进程有直接关系，从而促进了乳腺癌细胞的侵袭和转移［20］。IL⁃17A 可以通过增强p38MAPK 的磷酸化，间接的增加了肺癌细胞中MMP⁃2 和MMP⁃9 的表达，从而促进了肺癌的迁移和侵袭［21］。VEG⁃FA 在肝癌组织中表达上调，其在氧化应激状态下诱导形成促癌炎症微环境，在抑制肝癌细胞凋亡的同时促进了癌组织中血管的生成以及癌细胞的侵袭转移能力［22］。目前，从泽漆中分离发现的150 多种化学成分，主要包括黄酮类、萜类及多酚类等。其中，大戟素M 被证实具有较强的肿瘤抑制作用［23⁃25］。

综上所述，泽漆水煎液能够多成分、多靶点的参与多个生物进程，影响机体的生理功能，进而发挥抗肿瘤和抗炎的功效。