Alternaria perpunctulata NBERC_H56菌株对马唐的除草活性及其次级代谢产物的分离鉴定

吴兆圆，任梦瑶，张志刚，刘 芳，张亚妮，方 伟

（1.湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064；2.武汉科技大学医学院，武汉 430081）

利用微生物及其代谢产物来开发新型除草剂是国内外研究的热点之一，而从罹病的杂草植株上分离强致病性的病原菌则是发掘微生物（源）除草剂的主要手段［1］。其中利用最多的是植物病原真菌，有超过40个属的真菌已经或者正在被考虑开发成生物除草剂［2］。马唐（Digitaria sanguinalis）是禾本科单子叶植物，是一种秋熟作物农田中的杂草，在热带和温带地区的36个国家均有分布，对30多种农作物的生产有严重危害［3］。国外有报道利用弯孢属病原真菌Curvularia intermedia［4］及马唐黑粉菌（Ustilago synthersmae）［5］作为马唐生防菌剂。在国内，海南大学利用新月弯孢菌（Curvularia lunata）［6］，南京农业大学利用画眉弯孢菌（Curvularia eragrostidis）［7］，浙江师范大学利用从马唐罹病叶片上分离得到的炭疽菌Colletotrichum hanaui［8］进行 了对 马 唐的 防 治研究，均取得一定效果。尽管已报道的对马唐有致病性的菌株有很多，但是真正商品化的防除马唐的微生物制剂种类相对较少。因此，继续筛选马唐生防菌株能够为研发新型、高效的生物除草剂提供微生物品种资源，具有重要的科学意义和广泛的应用前景。湖北省生物农药工程研究中心课题组从罹病的马唐植株上分离得到1株病原真菌NBERC_H56，经鉴定为链格孢属真菌Alternaria perpunctulata，并发现其发酵液对马唐幼苗的生长具有明显的抑制作用，盆栽喷雾14 d试验结果显示对马唐鲜重的抑制率为75.6%。为明确菌株NBERC_H56的除草活性物质基础，对菌株进行了大量发酵、提取以及分离纯化，并经LC-MS和NMR鉴定，现将试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器和主要试剂

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振仪（TMS为内标，δ为mg/L，J为Hz）（德国Bruker BioSpin公司）；Bruker APEX DUO单晶衍射仪（铜靶衍射）（德国Bruker BioSpin公司）；Waters 2695液质联用仪（美国Waters公司）；Waters 2767高效液相制备仪（Waters 2525泵，带2767自动收集系统，2996二级管阵列检测器，色谱工作站Masslynx V4.0）；美国Sunfire C18 OBD制备柱（5μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，爱尔兰）；100～200目柱色谱填料柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）。分离提取试剂乙酸乙酯为中国医药集团有限公司生产，HPLC制备用乙腈为湖北弗顿科学技术有限公司生产。

1.2 马唐致病真菌的分离

菌株分离自湖北省武汉市郊区乌龙泉马唐罹病植株（2020年6月采样），现菌种保存在湖北生物农药工程研究中心，编号NBERC_H56。

将马唐罹病植株用乙醇浸泡15 s，无菌水漂洗3次，用灭菌滤纸吸干残留水分后剪碎，置于研钵中捣碎，随后加入5 mL无菌水，取0.1 mL混合液于装有PDA培养基的培养皿中涂匀，28℃恒温保湿培养，每天观察菌种生长情况，待菌体长出后，挑选菌株边缘菌丝进行培养，如此反复至得到纯净的菌体。

1.3 菌株的培养及活性测试

NBERC_H56发酵培养基：麦芽糖6.25 g/L，麦芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氢钾1.25 g/L，硫酸镁0.625 g/L，pH调至7.0。

将NBERC_H56菌株接种于已灭菌的装有100 mL上述培养基的250 mL锥形瓶中，加入0.3%琼脂，于28℃静置培养7 d。

选取营养状态相同、4叶期马唐，取适量菌株发酵液采用喷雾法对马唐幼苗进行喷洒（90 mL/m2），以含0.1%吐温-80的无菌水作为空白对照，每次试验设3个重复，每个试验重复3次，28℃，光照强度8 000 lx。14 d后对株高、根长进行测量，对鲜重进行称量，计算抑制率。抑制率=［（对照平均株高或根长或鲜重-处理平均株高或根长或鲜重）/对照平均株高或根长或鲜重］×100%。

1.4 菌株的大量发酵、提取及次生代谢产物分离纯化

按照上述培养基及培养条件发酵100瓶（10 L），发酵完成后合并发酵液，加入10 L的乙酸乙酯搅拌提取3次，提取液过滤后真空浓缩得到提取物1.45 g。提取物用少量甲醇溶解，经硅胶柱色谱进行柱层析，用石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，洗脱组分通过HPLC检测合并为6段（Fr.1至Fr.6）。主要组分Fr.4（1.06 g）经制备色谱柱（Sunfire C18 OBD制备柱，5μm，19 mm×250 mm，24 mL/min）进行分离，洗脱梯度为5%～100%乙腈，洗脱40 min。

2 结果与分析

2.1 菌株NBERC_H56的除草活性

如表1、图1所示，菌株NBERC_H56发酵液（简称H56发酵液）盆栽喷雾14 d对马唐幼苗的株高、根长及鲜重有明显的抑制作用，抑制率分别为55.6%、45.1%和75.6%。

表1 菌株NBERC_H56发酵液对马唐的株高、根长以及鲜重的抑制率

图1 菌株NBERC_H56发酵液对马唐的生长抑制作用

2.2 化合物的结构鉴定

洗脱组分通过HPLC检测、分离、纯化，得到化合物1（7.89 mg）、化合物2（8.86 mg）和化合物3（6.50 mg），其结构如图2所示。

图2 菌株NBERC_H56产生的化合物结构

化合物1：淡黄色粉末，分子式为C12H14O5，分子量 为238.2；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：6.31（1H，d，J=2.1 Hz，H-6′），6.15（1H，d，J=2.1 Hz，H-4′），4.04（2H，dd，J=14.2，7.1 Hz，H2-1″），3.47（2H，s，H2-2），2.40（3H，s，H3-8′），1.18（3H，t，J=7.1 Hz，H3-2″）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：202.6（s，C-7′），171.4（s，C-1），160.2（s，C-3′），158.8（s，C-5′），136.2（s，C-1′），120.1（s，C-2′），111.1（d，C-6′），102.1（d，C-4′），60.4（t，C-1″），39.53（t，C-2），32.6（q，C-8′），14.6（q，C-2″）。以上核磁数据与文献［9］报道的Curvulin的核磁数据基本一致，确定该化合物为Curvulin。

化合物2：黄色油状物，分子式为C14H10O5，分子量为258.3；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：7.24（1H，d，J=1.8 Hz，H-6），6.72（1H，d，J=2.4 Hz，H-5′），6.64（1H，d，J=2.4 Hz，H-3′），6.36（1H，d，J=1.8 Hz，H-4），2.71（3H，s，H3-7′）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：166.4（s，C-4），165.2（s，C-7），165.2（s，C-5），164.6（s，C-3），159.0（s，C-4′），153.1（s，C-2′），138.8（s，C-6′），138.6（s，C-1），118.0（s，C-5′），109.5（s，C-1′），105.0（d，C-6），102.1（d，C-3′），101.5（d，C-4），97.6（s，C-2），25.7（q，C-7′）。以上核磁数据与文献［10］报道的Alternariol的核磁数据基本一致，确定该化合物为Alternariol。

化合物3：淡黄色粉末，分子式为C15H22O4，分子量 为266.3；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：6.91（1H，s，H-6），5.45（1H，t，J=6.7 Hz，H-2′），4.57（2H，d，J=3.4 Hz，H2-7），4.54（2H，d，J=6.7 Hz，H2-1′），4.49（2H，s，H2-8），3.65（3H，s H3-9），2.05（3H，s，H3-10），1.76（3H，s，H3-4′），1.72（3H，s，H3-5′）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：158.2（s，C-3），157.5（s，C-7），165.2（s，C-5），141.9（s，C-1），137.3（s，C-3′），120.7（s，C-2），120.3（s，C-4），117.0（d，C-3′），106.8（d，C-6），65.1（t，C-1′），63.6（t，C-7），61.9（q，C-9），60.6（t，C-8），26.0（q，C-4′），18.5（q，C-5′），9.6（q，C-10）。以上核磁数据与文献［11］报道的Zinniol的核磁数据基本一致，确定该化合物为Zinniol。

3 讨论

通过筛选，本课题组从罹病的马唐植株上分离得到1株链格孢属杂草病原真菌Alternaria perpunct⁃ulataNBERC_H56，活性测试结果表明其发酵液对马唐幼苗的生长具有明显的抑制作用，并且从菌株NBERC_H56的次级代谢产物中得到化合物Curvu⁃lin（1）、Alternariol（2）和Zinniol（3）。据文献报道，Curvulin（1）主要由内脐蠕孢属（Drechslera）和弯孢属病原真菌产生［9］，对马齿苋（Portulaca oleracea）和刺苋（Amaranthus spino）具有植物毒性［12］，而Alter⁃nariol（2）和Zinniol（3）均为链格孢属真菌产生的植物毒素［11，13］，由此可初步推断化合物1、化合物2和化合物3均为菌株NBERC_H56产生除草活性的物质基础。

本次试验首次发现链格孢菌Alternaria perpunct⁃ulata对马唐具有生长抑制作用，并且首次对该菌的次级代谢产物进行了研究，分离得到3个具有除草活性的化合物，初步阐明了活性物质基础，下一步可对菌株NBERC_H56的除草活性进行深入研究，为真菌源除草剂的发现提供良好的研究基础。