正压式线虫快速富集装置对土壤线虫分离效果的研究

孙萌，董荟慧，赵雅津

（1 大连海关技术中心，辽宁大连 116001；2 大连海关综合技术服务中心，辽宁大连 116001）

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

供试土壤样本：大连市荒地土壤；体式显微镜：ZEISS AXIO ZOOM V1.6；光学显微镜：ZEISS Discovery；线虫快速分离器：自制。

1.2 方法

1.2.1 线虫快速分离装置原理。正压式线虫快速分离装置是由大连海关技术中心设计和研发的一款新型植物线虫快速分离装置，目前，已向国家知识产权局申请实用新型专利，申请号为202021899804.7。其工作原理是采用正向压力，使水流携带土壤快速穿过由不同孔径的筛网组成的快速富集系统，筛去大部分土壤内的植物组织、土壤颗粒、杂质，达到线虫与土壤分离的目的。

压差法植物线虫快速富集装置，包括密封筒体、气泵、漏斗筛网系统、进排水系统。密封筒体上连接用于测量用的压力表，气泵连接至密封筒体内，漏斗筛网系统连接于密封筒体下方，包括多层目数不等的套筛，且套筛的目数从上至下层依次增加。进排水系统包括连接于密封筒体上的出水口与入水口，还包括连接于漏斗筛网系统下方的排水阀。

本装置使用时，先将要处理的样品放入密封筒体内，将土壤样品尽量搅拌均匀。封闭舱门，向筒体内注水，当水面达到一定高度时停止，封闭排气阀，打开气泵增压，当压力达到一定值时停止。打开最下端排水阀，待压力表3 回零后，拆下最下层筛网，冲洗并收集下层筛网中的物质，即可得到线虫悬浮液。

1.2.2 线虫快速分离器分离土壤样本方法。选取植被茂盛的潮湿土壤，将植物表面部分用锄头除去后，疏松土壤表面，挖至下层2～3cm 处。铲取松动的土壤，将其密封在密封袋中，带回实验室4℃保存备用。取上述土壤50g 至于烧杯中，向烧杯内注水400mL，充分搅拌均匀后静置20s，将上浮液缓慢倒入线虫分离器密封筒体内。盖上桶盖、密封把手，关闭排气阀、入水口、出水口，按下绿色按钮，气泵开始向密封筒体内加压，观察压力表，当压力达到一定量时，按红色按钮停止加压。打开底部排水阀，待水完全排干后，打开排气阀，桶内气体完全排空后，取下漏斗及筛网，收集底部1～2 层筛网上的物质得到线虫悬浮液，对其进行镜检并计数。

1.2.3 析因试验设计。为研究线虫快速分离装置可控因子，对线虫分离效果的影响及因子间的相互作用进行分析，根据装置设计，采用2 因子2 水平试验设计。装置工作时的筛网组合V1和最大压力差V2为2 个可变因子，每个因子分别设计低、高2 个水平，每个因子的组合进行3 组重复试验（见表1）。使用Minitab 软件，对因子水平进行完全随机化试验设计，即随机对每种水平、每个因子的试验按顺序安排，以规避装置重复或规律性地进行一种水平试验带来的误差。

表1 因子水平设计

1.2.4 线虫分离效果评价。线虫计数方法：将线虫分离液倒入大号培养皿中，在立体显微镜下进行观察。取6倍目镜与10 倍物镜组合的1 个视野作为计数单位，共计数5 个视野。设1 个视野在整个培养皿中的占比为X，5 个视野中线虫的数量分别为Ni，用于分离的土壤用量为m，则1g 土壤中分离得到的线虫数量n 通过下式可得：

2 结果与分析

2.1 试验数据处理

按照1.2.3 中的顺序进行试验，得到试验结果（见表2）。

表2 各因子水平组合试验结果

用minitab 软件对结果进行方差分析，结果（见表3）。

表3 方差分析表

2.2 结果分析

取置信水平α=0.05，通过分析结果可得：（1）模型适用程度的P 值＜0.05，结果十分显著，说明使用此方法估计正压式线虫快速富集装置，对土壤线虫的分离效果有利。（2）因子V1（筛网组合）对结果影响不显著，既筛网组合方式并不直接影响装置对土壤线虫的分离效率。（3）因子V2（工作压力差）对结果影响显著，也就是说，采用的压力差很大程度上会影响装置对土壤线虫的分离效率。（4）2 因子的交互作用对结果影响十分显著，表明该装置在不同孔径的筛网组合下，压力差对线虫分离效率的影响可能呈现完全不同的趋势。

3 结论及讨论

通过数据分析可知，在采用较粗糙的筛网组合（100目—200 目—200 目—500 目）时，装置的线虫分离率随着压力差的增加而增加。但在采用较细密的筛网组合（100 目—200 目—400 目—500 目）时，装置线虫分离率随着压力的升高反而下降。如采用第一种筛网组合，0.06Map 压力差时，装置的分离效率达到最高。一般认为，400 目、500 目标准筛网是线虫无法通过的孔径，此筛网上即可收集到线虫。而具有400、500 目筛网的筛网系统中，线虫分离效率随压力升高而降低，主要原因可能是由于使用较细密的筛网（100 目—200 目—400目—500 目）。当压力升高时，会使土壤颗粒和胶体迅速封堵住400 目的筛网，使其通透性大大降低，从而使整个筛网系统分离效率下降。最下层的500 目筛网不会大量富集线虫，因此，导致分离效率下降。使用较粗的筛网（100 目—200 目—200 目—500 目），更高的压力会使水流更快速地穿过筛网，使土壤中的线虫更彻底地被冲洗出来。因此，在使用此装置分离土壤线虫时，首先应避免使用过于细密的筛网组合，其次提高压力差，以获得更高的线虫分离效率。

综上所述，研究表明，采用正压式线虫快速富集装置，快速分离和收集土壤中的活体线虫有效、用时较短且容易观察。通常采用传统的贝尔曼漏斗法，平均分离时间为16～24h；采用过筛法，虽然时间可以缩短至1h，但分离出的线虫悬浮液通常含有大量土壤杂质或胶体，严重影响线虫的观察和种类鉴定。采用正压式线虫快速富集装置，分离时间为20～30min，缩短了线虫分离所需时间，且分离出的线虫悬浮液中杂质和土壤胶体的含量较过筛法少，平衡了分离时间和杂质干扰的问题。

不同的线虫分离法，对各种类群的线虫和不同体型的线虫分离效果存在差异。贝尔曼漏斗法由于其原理是依靠线虫的活性和趋水性，分离出的线虫以活体线虫为主，且对线虫活性有一定要求，当处于线虫不活跃的季节，分离率会受到影响。过筛法可得到死体和活体线虫，由于依靠自然重力通过筛网。因此，对筛网孔径有一定要求，分离出的线虫在体型上有一定局限性。正压式线虫快速富集装置由于依靠压力差进行分离，筛网孔径组合有一定灵活度，在分离出的线虫体型方面较过筛法范围更广，且可以分离出死体和活体线虫。由于分离时间短，可能导致某些种类，尤其是植物内寄生线虫没有充分游离出寄主，就和寄主一同被筛网系统挡住。因此，分离得到的线虫种类可能会有一定局限性，如时间充裕，可尝试将土壤样品浸泡1～2h，使某些种类的线虫更充分地游离出植物组织，以得到种类更为全面的线虫种类。

关于正压式线虫快速富集装置分离线虫的效率与传统分离方法的对比及分离得到线虫的种类差异等方面，还需进一步详细研究，以期该装置在口岸线虫检疫和土壤线虫研究工作中得到推广应用。