药源微生物遗传育种的研究进展

仝倩倩，李亚亮，王顺昌，颜守保

(1.淮南师范学院 生物工程学院，安徽 淮南 232038；2.资源与环境生物技术安徽普通高校重点实验室，安徽 淮南 232038)

0 引言

微生物药物是指微生物发酵产物或其衍生物研发的医药产品[1].药源微生物菌种性状的好坏，直接关系到目标产物的产量与品质，对药物的高效率制备极其重要.因此，药源微生物菌种遗传育种技术在现代生物技术中，尤其是在生物制药中具有重要的地位.药源微生物遗传育种从常规的自然育种发展到诱变育种、原生质体融合育种、基因组重排育种及基因工程育种，改良甚至改变菌种遗传特性，大大提高了药源微生物育种的效果.文章主要从方法技术、理论机理、应用和发展前景等方面综述药源微生物遗传育种的研究进展.

1 自然育种

自然育种是利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程[2].在工业菌种保藏中，可通过自然选育分离纯种，防止菌种衰退，并对已经衰退的菌种进行复壮；或在工业大生产中，从生产水平高的批次中，分离出高产菌株，提高发酵产量，保藏并用于稳定生产.一般不直接用于药源微生物的菌种选育.

2 诱变育种研究及应用概况

诱变育种，是利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法.诱变育种包括诱变和筛选两部分，关键是选择出发菌株、确定诱变剂种类和剂量.

2.1 物理诱变

物理诱变主要是由高能辐射引起微生物遗传物质的变异.传统物理诱变剂有紫外线、微波、各种射线、超声波等[3].紫外线(UV)使用最早，当微生物DNA吸收紫外线之后，DNA双链会形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起遗传特性的改变[4].微波是一种高频率电磁波，可刺激极性分子快速震动，从而发生遗传变异[3，5，6]；微波诱变可直接使用家用微波炉，实际推广应用更具优势，但要注意微波热效应，一般需采用加冰等降温冷却手段，消除辐射过程中产生的热效应.

林可霉素是由林可链霉菌(Streptomyceslincolnensis)产生的一种抗生素，主要用于治疗由革兰氏阳性菌引起的疾病.El-Sherbini等[7]利用紫外诱变照射S.Lincolnensis，获得60个突变株，其中有34个表现出比野生型菌株更高的林可霉素产量(从77.69%上升至84.62%).笔者等[8]利用微波诱变结合链霉素抗性筛选动物抗生素维吉尼亚霉素高产菌株维吉尼亚链霉菌(Streptomycesvirginiae)，正突变率高达32.83%；并获得一株高产菌株MW 178((146.72±11.80) μg/mL)，较出发菌株((21.24±1.34) μg/mL)提高了约6倍.

近年来，育种工作者还开发出一些新型的物理诱变剂.离子注入技术是1986年由中科院余增亮等首次应用于农作物品种改良，它是集化学诱变及物理诱变为一体，存活率随注入剂量增加呈现先降后升再降的“马鞍型”变化[9-10]，可达到10%～20%的高突变率，在药源微生物菌种育种中起着重要的作用.清华大学研发了专门应用于生物诱变育种的常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)诱变育种仪，获得业界的广泛认可.ARTP诱变育种仪是一种新开发的基于大气压射频辉光放电等离子体的全细胞诱变工具，具有比UV辐射或化学诱变剂更高的突变率，产生的高活性粒子可改变微生物细胞壁或细胞膜的结构及通透性，并发生基因损伤，最终导致微生物突变[11].但ARTP诱变育种技术仍处于发展阶段，很多问题还有待进一步研究，如ARTP诱变育种对各种生物分子作用机理，ARTP诱变育种对于不同生物种的代谢过程、生理及遗传的影响机制等.

阿维菌素类药物作为一类动物抗寄生虫药剂和植物杀虫剂，被广泛应用于农业和畜牧业，Wang等[12]利用12C6+重离子诱变技术处理阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)，成功筛选出阿维菌素B1a高产突变株，最高一株ZJAV-Y-147突变株产量达4 822.23 μg/mL，其产量是出发菌种的2倍.阿魏酸作为阿魏、木贼、当归等多种中药的有效成分之一，Liu等[13]为了获得提高拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)对阿魏酸的耐受力，采用大气压辉光放电低温等离子体诱变技术结合高通量筛选，获得能耐受0.9 g/L的突变株NCIMB 8052和M11，揭示Cbei _ 4693基因在调控阿魏酸发酵过程中起到了重要的作用.

2.2 化学诱变

化学诱变剂是一类化学物质，如烷化剂、碱基类似物、移码突变剂等，由于其诱变效果好且经济，因此在实验室中被广泛应用.然而，化学诱变剂大部分是致癌物质，使用必须十分谨慎.操作者需要作好自身防护，避免诱变剂与皮肤接触，防止吸入蒸气，导致白血病等恶性疾病的发生；另外，要防止污染环境.

常用的烷化剂有亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)、甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)及硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)等[3].其中，NTG又称超诱变剂，能使DNA分子上的碱基及磷酸烷化，从而发生遗传性变异，影响微生物代谢途径[14-15].NTG是一种强致癌物质，在操作时要十分小心，作好防护，如要戴橡胶手套，戴口罩，在通风橱中称量等[3].碱基类似物是结构类似于天然四种碱基的物质，这类诱变剂诱变生长旺盛的微生物，可以取代核酸分子中碱基的位置，效果较好，因此也被称为掺入诱变剂.一般来讲，碱基类似物与其他物理及化学诱变联合使用效果会更好，是一种增敏剂，提高突变率.

宋芳等[16]采用250 μg/mL的NTG对出发菌株紫金牛叶杆菌(Phyllobacteriummyrsinacearum)RC6b进行化学诱变后，其中菌株N-RC6b2对二苯砷酸的降解率最高，由出发菌株的低于2%提高到36.71%，效果显著.杜婵娟等[17]为了提高生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)对香蕉炭疽病的抑菌活性，采用紫外线/亚硝酸钠复合诱变的方法对短短芽胞杆菌 Bb5911 进行诱变，复筛得到一株突变株5B37-3，对13种植物病原真菌的抑菌活性提高18.20%～239.27%.

2.3 复合诱变

长期使用一种诱变剂会产生“疲劳效应”，实际生产中往往采用多种诱变剂复合处理的方法进行菌株诱变，提高诱变效率.黄文福等[18]为了提高在临床上常用的抗生素林可霉素的发酵水平，以林可霉素LK15-35为出发菌株，采用氯化锂、常压室温等离子体和紫外线三重复合诱变，最终获得高产突变株LK16-77，摇瓶发酵单位比出发菌株提高30.0%.

2.4 筛选

诱变育种技术由于是非定向突变，所以一般会结合特定的筛选方法，如抗生素抗性、耐前体类似物抗性等，提高正突变率，从而提高筛选效率.1998年，文献[19-21]提出了一种可以广泛用于提高微生物抗生素(次级代谢产物)产量的方法——链霉素耐药性筛选，该法正突变率频率高、具有广谱性，对许多抗生素产生菌抗性突变株的筛选都有较好的效果.另外，在生物合成中，代谢产物过量积累时常会出现反馈调控作用，抑制途径中有关酶的合成或活性，导致代谢产物产量下降.由于初级代谢中某一段造成的反馈阻抑而影响次级产物产量的现象，因此可通过耐前体结构类似物的突变加以消除[3]，使突变株能不断产生参与合成代谢产物的前体，从而提高代谢产物的产量.

作为肿瘤化疗重要药物的博来霉素，Zhu等[22]为了提高其产量，利用紫外诱变和抗生素抗性筛选对重组菌株StreptomycesflavoviridisSB9026进行改良，成功获得一株高产突变株G-4F12，其产量超过70 mg/L，比出发菌株提高了7倍.在利用酿酒酵母产腺苷蛋氨酸(SAM)的诱变育种中，蛋氨酸是合成腺苷蛋氨酸的底物，乙硫氨酸是蛋氨酸类似物，提高酿酒酵母细胞内乙硫氨酸抗性基因的表达，促进细胞对高浓度乙硫氨酸的耐受性，从而提高酿酒酵母腺苷蛋氨酸的产量.Cao等[23]首先对酿酒酵母CGMCC 2842 进行紫外诱变，然后再利用高浓度的乙硫氨酸筛选，得到了一株耐前体类似物的突变株，SAM产量较出发菌株提高2.7倍，在15 L发酵罐中产量达6.1 mg/L.

3 原生质体融合育种

原生质体融合是去除细胞壁后，由原生质膜包裹的球形裸细胞，然后再诱导裸细胞融合，从而实现全基因组交换，最后经特定的筛选方法获得含有双亲遗传特征的融合子.原生质体融合具有以下优点：1)重组频率高；2)重组的亲本范围大，可实现远缘杂交；3)融合时亲本染色体整体参与交换，集合优良性状的可能性更大[24].原生质体融合技术在微生物育种中应用相当广泛，主要包括提高产量或质量、合成新物质、改良菌种遗传特性、优化菌种发酵特性、转移质粒、融合原生质体与细胞核及进行遗传分析等.

制备原生质体主流做法是酶解法.由于不同微生物细胞壁组成不一样，因此去壁需要的酶系、酶量也存在着差异.另外，培养基成分、菌龄和预处理等因素对原生质体的制备也有影响[3].赵文超等[25]在探索制备高纯度茂源链霉菌原生质体悬液条件时，考察了二级菌丝培养基中所添加的甘氨酸的浓度对原生质体制备率及再生率的影响，发现当甘氨酸约为5 mg/L时，能得到最优的原生质体的制备率；二级菌丝培养至对数生长期中期时，原生质体的制备效果最佳.潘淼等[26]在研究高山被孢霉高产花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)的原生质体融合子筛选时，考察不同溶菌酶系对高山被孢霉原生质体释放的影响，发现在混合酶为蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶的基础上加入几丁质酶，酶解3 h后，更有助于高山被孢霉原生质体的释放.

去除细胞壁后的原生质体能够再生，能够正常地生长和分裂.影响原生质体再生的因素有很多，如再生培养基的组成、酶解条件等[27-28].一般会在培养基中添加一些营养因子，促进细胞壁的再生.另外，酶浓度、酶解时间及温度对原生质体的再生亦有很大的影响.如果酶浓度太高且酶处理时间过长，细胞可能脱壁完全，导致再生率显著降低.Liu等[29]考察了Rhizoctoniasolani原生质体再生的培养基，发现最佳的固体再生培养基为1% V-8，再生率达65%；最佳的液体固体再生培养基为10%土豆葡萄糖培养基，再生率达34%.

融合子检出方法很多，可根据微生物及实验目的进行选择，具体4种筛选方法见表1.传统的营养缺陷型标记筛选法，要首先筛选获得营养缺陷型突变株，工作量较大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性状丧失或降低，操作性不强.其次，1984年，Bradshaw和Peberdy[30]首次利用抗药性筛选融合子，将抗吖啶黄的Apergillusnidulans营养缺陷型和不抗吖啶黄的A.rugulosus菌株进行融合，并涂布到含有吖啶黄的基础培养基上，进行融合体筛选.该方法相对于营养缺陷型标记筛选法更有针对性，然而微生物的抗药性是由遗传物质决定的，不同微生物抗药性差异较大，所以对微生物要求较高.再者，可利用荧光染色筛选融合子，将原生质体染色，让其带有不同颜色的荧光探针，融合后可在荧光显微镜下直接挑取融合子.潘淼等[26]首次将流式细胞仪分选技术用于筛选高山被孢霉原生质体的融合子，将用不同的荧光染料标记双亲原生质体，通过流式细胞仪分选融合子，成功获得一株ARA高产菌株.最后，可采用灭活法检出融合体，其原理是采用不同灭活方法(如热、紫外、化学试剂等)灭活双亲本，使亲本原生质体死亡，但细胞融合后，由于死亡的亲本之间可以互补，从而会再生出融合子[31-32].陈凯等[33]利用加热-紫外灭对两株亲本哈茨木霉(Trichodermaharzianum)TW21990和木霉(Trichodermasp.)TW21990-1进行原生质体融合，成功筛选获得遗传稳定并能防治番茄猝倒病的理想菌株Tpf-2，该融合子对引起的番茄猝倒病的这两种腐霉均有防治效果，防治效果分别达到86.3%和85.7%.

表1 融合子检出方法

4 基因工程育种研究及应用概况

广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状，或者利用后者作为表达场所来生产目的产物的育种方法.然而，真正意义上的微生物基因工程育种应该仅指那些以微生物本身为出发菌株，利用基因工程方法进行改造而获得的工程菌，或是将微生物A的某种基因导入到微生物B中，使B具有A的某些性状或表达A的基因产物而获得新菌种.

基因工程育种的特点是能够按照人们的意愿事先设计和控制，并有能力在极端错综复杂的生物细胞内取出所需基因，并人为地将此目的基因在试管中进行剪切、拼接、重组并转化到受体细胞中，经无性繁殖获得增产数百数千倍的新型蛋白质，能在动植物和微生物间进行任意的、定向的远缘杂交，这是基因工程最突出的优越性[2].

4.1 基因组重排育种

基因重排育种技术(Genome Shuffling，简称GS)是21世纪初开发的一种针对整个基因组的定向菌种改良技术，它不需要事先了解菌株遗传背景，基于传统的诱变育种，实行递推式细胞融合，累积正向突变菌株的优良性状，进而提高微生物的正突变频率及速度，目前已成为一种高效的改造微生物的育种方法[34].

融合体的检出和鉴别是基因组重排育种技术中非常重要的一步.常用的重组体筛选方法可以根据基因组重排目的进行设计，利用提高菌株对环境的耐受力，或设计含有高浓度的物质的选择培养基来进行筛选.Gérando等[35]利用两轮基因组重排技术提高ClostridiumbeijerinckiiDSM 异丙醇的耐受性，从野生型耐受的35 mg/L提高到50 mg/L，最终重组体异丙醇和正丁醇的生产能力比野生型分别提高了23%和21%.重组体还可以利用钝化法，即利用灭活法或营养缺陷型原生质体来筛选.高血压药物缬沙坦的主要原材料L-缬氨酸应用广泛.Huang等[36]利用基因组重排技术处理BrevibacteriumflavumMDV1用于提高缬氨酸的产量，经过2轮重排后，筛选出6株高产L-缬氨酸突变株，其中一株遗传稳定突变株MDVR2-21在摇瓶中发酵产量达30.1 g/L，比MDV1高6.8倍.另外，成功进行基因组重排的挑战之一是缺乏高通量筛选方法，并能够在重排后快速有效地鉴定所需表型[37].有的研究人员则借助缩小的微孔板培养体系，结合快速的筛选方法进行重组子筛选.如，Chen等[38]利用96深孔板培养体系培养产雷帕霉素的融合体，结合酶标仪的方法快速筛选高产重组体.笔者[39]利用24深孔板培养体系结合管碟法快速筛选技术，快速筛选产量较高的重组体.

4.2 易错聚合酶链式反应技术

易错聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是通过改变PCR条件，降低DNA复制的保真度，使碱基发生随机错配，从而产生不同的突变体，再从该突变体文库中筛选出具有目的表型的突变株.

闫鸽等[40]利用易错PCR技术对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab13基因进行随机诱变，构建突变文库，以提高作物抗虫性，最后成功获得具有高效杀虫活性突变株Cry1Ab13-1.通过序列分析表明，该突变株序列与原始碱基序列有97.79%的一致性，有2个碱基发生了突变，导致该基因编码的氨基酸序列中有2个氨基酸改变，该氨基酸序列与原始氨基酸序列有96.97%的一致性.该基因与已知过敏原的同源性低于35%，不存在致敏性.处理72 h时表达的目的蛋白对小菜蛾幼虫的致死率达87.88%，明显高于未突变基因对照组的幼虫死亡率；对亚洲玉米螟幼虫的致死率达81.11%，而且存活的亚洲玉米螟幼虫的生长发育受到明显抑制.

4.3 启动子组合

启动子活性对基因转录水平有决定作用，但宿主细胞的原始启动子可能无法高效启动外源基因的表达，为此科学家借助启动子组合技术，通过合理组合增强子元件和核心启动子，来增强启动子转录能力，从而提高外源基因的表达.

埃博霉素及其衍生物作为一种应用前景广阔的抗肿瘤药物，已经在临床试验并在市场上推广，它是由纤维堆囊菌产生的一种包含多种结构及衍生物的大环内酯类药物.崔潇文[41]为了改变纤维堆囊菌产量低、代时长的缺点，构建了新的埃博霉素基因启动子簇，并将其插入至新药物重要来源的黄色黏细菌中，结果显示埃博霉素产量得到明显提高，最高一株产量比原始菌株提高了113%.

4.4 基因序列改造与优化

临床医学中的很多药物是通过转基因技术将某药物基因编码序列转到受体细胞中完成高表达，但由于外源基因与宿主细胞基因差别太大，外源基因的表达会受到严重的影响，因此，需要对基因序列进行改造和优化，从而实现外源基因在宿主细胞中的高表达.

于荣荣[42]为了提高人干扰素α-2b基因在大肠杆菌中的表达量，将人干扰素编码序列(CDS)改造成大肠杆菌高表达基因的偏好模式，并配以启动子区和终止子区序列以构成完整基因，结果表明在克隆载体中，改造后的基因(GGB基因)表达量比编码序列改造前的基因(GWGB基因)的表达量提高了55.1%，高表达SD基因的表达量比低表达的提高了52.8%；在表达载体中，编码序列改造后的基因的表达量比改造前的提高了9.1%，高表达SD基因的表达量比低表达的提高了18.2%.

5 展望

遗传育种方法在提高农用抗生素、药源抗生素及其他活性物质产生菌的产能方面取得了突出成果，药源微生物的产率及生产性能大幅度提升.目前，大多数药源微生物诱变育种是围绕着如何提高菌株产能相关内容进行的.

物理诱变、化学诱变等均属于非定向诱变，对于药源微生物改良有很好的成效，这类诱变技术往往是几种诱变技术联合使用，且越来越倾向于利用新型诱变技术开发性状优良的菌种；而且此类诱变技术为了提高突变频率，研究人员会通过设计高效的筛选技术，利用筛选培养基或其他相关方法，从大量菌株库中筛选正突变株.因此，非定向诱变的筛选技术在选育工作中占据了非常重要的地位，它是提高诱变效率的基础.基因工程技术是药源微生物菌种选育中非常重要的定向诱变技术，它们不仅可以提高目标产物的产量，获得对某种环境的耐受性，改良药源微生物，甚至可以引进新的代谢途径，从而改变菌种.虽然这些定向诱变育种技术比传统诱变育种技术的突变频率高很多，但是仍然需要借助定向的筛选方法，高效快速的高通量筛选技术的建立仍然是定向诱变育种的瓶颈.

另外，药源微生物诱变育种技术发展至今，真正利用诱变育种技术选育出的药源微生物较少，无法实现产业化，主要原因便是菌种稳定性不高，大部分在培养3代以后，突变株的稳定性大大降低，很难维持原有的优良性状，这是科研工作者在实际选育中亟须解决的关键问题.随着技术的进步与发展，更多更好的遗传育种技术(代谢工程、反代谢工程等)将应用到药源微生物菌种选育上来，为拓宽药源微生物资源相关领域提供新的研究方向.药源微生物要想最终实现产业化，解决药物资源匮乏的困境，必须要通过发酵的检验，菌种在满足“稳定”“经济”及“安全”前提下，与反应器放大工艺相结合，结合发酵过程调控，实现人们对药物的需求.