狭山野豌豆总黄酮富集工艺研究

桑育黎，刘景玉，郭方岩，辛跃强，石 磊，陈海刚，郝延军

(1.辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036；2.华润三九(郴州)制药有限公司，湖南 郴州 423000；3.辽宁中医药大学 中医药科学院，辽宁 沈阳 110032)

0 引言

狭山野豌豆为豆科野豌豆属植物，味甘、性平，具有活血、解毒、通络、行水的功效，为蒙药透骨草山野豌豆的变种，在民间亦作透骨草被广为使用.临床上多用在祛风除湿、活血止痛等病症.通过前期实验研究发现，中国药典狭山野豌豆具有多种黄酮类化学成分.目前多采用黄酮类化合物作为指标性成分对野豌豆属透骨草药材进行质量控制[1].实验以狭山野豌豆主要活性成分总黄酮含量为测定指标，对狭山野豌豆黄酮类化学成分的富集工艺进行了研究[2].

1 仪器与试剂

粉碎机RRHP-100型(香港欧凯莱芙有限公司)；电子天平(万分之一)(北京赛多利斯科学仪器系统有限公司)；恒温水浴锅(国华电器有限公司)；无水乙醇(分析纯)(天津市康科德科技有限公司)；大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；层析柱(沈阳瑞宝玻璃厂)；乙腈(色谱纯)(德国Merk公司)；磷酸(色谱纯)(天津市光复精细化工研究所)；超纯水器(法国MILLIPORE).

2 实验材料

狭山野豌豆2015年09月采集于辽宁省朝阳市朝阳县小塔子，经辽宁省药品检验检测院王维宁教授鉴定为豆科(Leguminosae)野豌豆属(ViciaL.)狭山野豌豆(V.amoenaFisch.Var.angustaFreyn.).样品保存于辽宁省药品检验检测院中药标本室.

3 实验方法与结果

3.1 样品溶液制备

精密称取狭山野豌豆药材粉末(4号筛)200 g，置5 000 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇溶液4 000 mL(按1∶20体积比例)，加热回流1 h，提取2次，提取温度为90 ℃，提取液合并，蒸干，蒸馏水溶解，定容至1 000 mL.

3.2 大孔树脂预处理

将10种大孔树脂用蒸馏水浸泡过夜，使其充分膨胀.再依次用30%、50%、70%、95%乙醇水溶液冲洗，直至95%乙醇水溶液流出液与蒸馏水(体积比5∶1)混合[3]，液体不浑浊.再依次用95%、70%、50%、30%乙醇水溶液以及水冲洗各大孔树脂，最终用蒸馏水冲洗至无醇味，备用.

3.3 大孔树脂静态吸附与解吸附筛选

3.3.1 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，见表1；体积流量1.0 mL·min-1；紫外检测波长为350 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL[4].

3.3.2 静态吸附实验

精密称定10种经过预处理的大孔树脂各1 g(干燥无水)，置于50 mL锥形瓶中，分别加入50 mL质量浓度为0.17 g·mL-1生药溶液(5种黄酮苷浓度c0为0.640 4 mg·mL-1)，时时振摇(120 r/min)，振摇2 h，过滤，取续滤液.按“3.3.1”项下色谱条件，测定5种黄酮苷含量，计算，结果见表1.

3.3.3 静态解吸附试验

取上述过滤得到的10种大孔树脂，分别置于50 mL锥形瓶中，分别加入50 mL 70%乙醇水溶液，时时振摇(120 r/min)，振摇2 h，过滤，取续滤液.按“3.3.1”项下色谱条件，测定5种黄酮苷含量，计算.结果见表1，数据表明HPD-826对狭山野豌豆总黄酮吸附与解吸附效果最好，适于狭山野豌豆总黄酮的富集.

表1 10种大孔树脂静态吸附与解吸附实验结果

3.4 HPD-826型大孔树脂动态吸附实验

3.4.1 上样浓度对HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮影响试验

称取5份经过预处理的HPD-826型大孔树脂各10 g(干燥)湿法装于各层析柱(Φ1.5 cm×20 cm)中，分别取0.2 g/mL生药质量浓度的样品50，100，200，400，800 mL，经过稀释或浓缩定容至200 mL，超声溶解，使样品充分溶解，分别上柱，控制流速为2 mL·min-1，收集流出液，过滤，以5种黄酮苷含量为指标进行检测[5].实验结果见图1.

由图1可以看出：当上样质量浓度达到0.1 g/mL时，HPD-826型大孔树脂对狭山野豌豆总黄酮的吸附率达到93.26%，其余浓度均低于90%.因此，将上样浓度定为0.1 g/mL.

图1 上样浓度对HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮的影响

3.4.2 pH对HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮影响实验

分别量取样品溶液(总黄酮质量浓度为0.385 6 mg·mL-1)100 mL，共5份，其中4份用1 mol·L-1HCl溶液或1 mol·L-1NaOH溶液调节pH范围1～2、3～4、5～6、7～8.将上述5份溶液依次加入HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，控制流速为2 mL·min-1，收集流出液，过滤，以5种黄酮苷含量为指标进行检测.实验结果见图2.

由图2可以看出：上样液体pH范围应定为5～6.

图2 pH对HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮影响试验

3.4.3 HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮泄漏曲线考察试验

将pH 5～6样品水溶液(总黄酮质量浓度为0.377 89 mg·mL-1)，加入预处理好的HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，调节流速为2 mL·min-1进行动态吸附，按树脂床体积数收集流出液，过滤，以5种黄酮苷含量为指标进行检测.实验结果见图3.

由图3可以看出：在工业化生产时若为单个树脂柱时上样体积为5倍树脂床体积，若为多个树脂柱串联时，则最宜上样体积为15倍树脂床体积.

图3 泄漏曲线考察试验结果

3.4.4 洗脱剂对HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮影响试验

分别量取pH 5～6样品水溶液(总黄酮浓度为0.377 89 mg·mL-1)200 mL，分别加入4根预处理好的HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，调节流速为2 mL·min-1进行动态吸附，收集流出液，滤过.先用水洗脱至近无色，再分别用30%、50%、70%和95%乙醇水溶液洗脱至近无色[6]，洗脱液过滤.将样品流出液和洗脱液以5种黄酮苷含量为指标进行检测.实验结果见图4.

根据图4，最终选取70%乙醇水溶液作为洗脱剂的最佳浓度.

图4 洗脱剂对HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮影响试验

3.4.5 HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮洗脱曲线考察实验

将pH 5～6样品水溶液(总黄酮质量浓度为0.359 25 mg·mL-1)200 mL，加入预处理好的HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，调节流速为2 mL·min-1进行动态吸附，收集流出液，过滤.先用水洗脱至近无色，再70%乙醇水溶液洗脱，以3 mL·min-1流速进行洗脱，按树脂床体积数收集洗脱液，过滤，将样品流出液和洗脱液按“3.3.1”项下色谱条件，以5种黄酮苷含量为指标进行检测.实验结果见图5.

由图5可以看出：10倍树脂柱床体积为最佳洗脱液体积.

3.4.6 HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮纯化工艺验证实验

将pH 5～6样品水溶液(总黄酮质量浓度为0.359 25 mg·mL-1)，加入预处理好的HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，上样体积为5倍树脂柱床体积，调节流速为2 mL·min-1进行动态吸附，收集流出液，过滤.先用水洗脱至近无色，再70%乙醇水溶液洗脱，以3 mL·min-1流速进行洗脱，洗脱体积为10倍树脂床体积数，收集洗脱液，过滤，将样品流出液和洗脱液按“3.3.1”项下色谱箱件，以5种黄酮苷含量为指标进行检测.实验结果见表2.

表2 HPD-826型大孔树脂纯化总黄酮工艺验证实验

4 结果与讨论

1)前期实验发现狭山野豌豆中可分离得到多个黄酮类化合物，狭山野豌豆的提取物对与免疫相关的TLR2、TLR4受体有激活作用[1]，且水提取物作用强度大于 95%醇提取物，推测狭山野豌豆的免疫调节作用可能来自黄酮类成分，因此优化狭山野豌豆总黄酮的富集工艺十分重要.

2)在前期实验中，得到通过乙酸乙酯萃取的方法富集狭山野豌豆总黄酮，其结果为3.147 0 mg/g，而通过HPD-826型大孔树脂对狭山野豌豆总黄酮富集，其结果为3.289 6 mg/g，因此，选取大孔树脂更适合狭山野豌豆总黄酮的富集，且经过10种大孔树脂对比，筛选出HPD-826为最佳型号.

3)本试验对上样质量浓度影响进行考察，依次为0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 g/mL，在质量浓度为0.1 g/mL时吸附率最大.对pH进行考察，范围依次1～2、3～4、5～6、7～8，在pH为5～6范围时吸附率最大.对洗脱剂进行考察，虽然95%乙醇水溶液对总黄酮的解吸附率最高，但考虑节约资源选取70%乙醇水溶液.因此，当上样质量浓度为0.1 g/mL，pH为5～6，洗脱剂为70%乙醇水溶液，洗脱体积为10倍树脂床柱体积时，HPD-826对狭山野豌豆总黄酮的富集效果最佳.