超高压液相色谱法测定水果和蔬菜中虫螨腈及其代谢物以及在甘蓝中的残留评价应用

王 坦1，孙 强1，沈沁怡1，陈珊珊1，温广月1，赵 莉2，董茂锋1*，王伟民1*

（1.上海市农业科学院农药安全评价研究中心，上海 201106；2.上海市农业技术推广服务中心，上海 201103）

虫螨腈又名溴虫腈，属于新型吡咯类杀虫杀螨剂，具有杀虫谱广、防效高及持效长的特点，在我国广泛用于大白菜、小白菜、柑橘、苹果等多种蔬菜和水果作物。但由于其持效长，在农产品中的半衰期较长，易造成残留，进而危害农产品质量安全，因此存在一定的膳食安全风险［1］。

虽然我国《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763－2019）［2］中虫螨腈的残留定义为虫螨腈，但联合国粮农组织和世界卫生组织农药残留联席会议（JMPR）报告分别对其残留和膳食风险评估规定了不同的检测要求，残留定义为虫螨腈，膳食风险评估定义为虫螨腈及其代谢物溴代吡咯腈，以虫螨腈与溴代吡咯腈10 倍之和计［3］。溴代吡咯腈是生产虫螨腈的重要中间体［4］。目前，国内外针对虫螨腈的检测方法较多，主要有液相色谱法［5－6］、气相色谱法［7］或气相色谱－串联质谱法（GC－MS/MS）［8］，而关于其代谢物溴代吡咯腈的相关报道较少，主要采用液相色谱［4］或液相色谱－串联质谱法（LC－MS/MS）［9］进行检测。我国食品安全国家标准GB 2763－2019 的推荐方法虽然满足虫螨腈的日常检测需求，但无法满足JMPR 关于虫螨腈膳食风险评估定义的要求。孙丰收等［10］将甘蓝样品采用乙腈提取，分散固相萃取净化后，利用GC－MS/MS检测虫螨腈，LC－MS/MS检测溴代吡咯腈，但由于采用两种检测技术，且前处理步骤繁琐，为日常检测增加了工作量。

本文建立了固相萃取净化结合超高压液相色谱同时测定水果和蔬菜中虫螨腈及其代谢物溴代吡咯腈的分析方法。该方法灵敏度高、选择性好，能够满足水果和蔬菜中虫螨腈及溴代吡咯腈残留的定量分析和膳食安全评价要求。为进一步验证所建方法的适用性，将该方法应用于360 g·L－1虫螨腈悬浮剂在甘蓝上的动态消解、最终残留测定和膳食风险评估，从而为虫螨腈的安全使用提供基础数据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC－30AD 超高压液相色谱仪配备二极管阵列检测器（SPD－M20A）、InertSustain C18色谱柱（2.1 mm × 150 mm，3.0 µm）均购于日本Shimadzu 公司；HR2101 食品粉碎机（荷兰Philips 公司）；MS 105DU 电子天平（感量：0.1 mg，最大量程：120 g，瑞士梅特勒公司）；数显多管涡旋混合器（美国Talboys 公司）；Hypersep C18固相萃取柱（500 mg/6 mL）、Thermo－Fisher ST16 离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；arium®mini 实验室超纯水系统（德国Sartorius 公司）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、CNWBOND GCB/NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL）、CNWBOND Florisil 固相萃取柱（500 mg/3mL）、CNWBOND NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL）、CNWBOND PSA 固相萃取柱（500 mg/6 mL）、CNWPoly－SeryHLB固相萃取柱（150 mg/6 mL，上海安谱实验科技股份有限公司）。

乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈、氯化钠、甲苯、无水硫酸镁（分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司）；多壁碳纳米管（南京先丰纳米材料科技有限公司）；有机相尼龙针式滤器（0.22 µm，上海安谱实验科技股份有限公司）。

虫螨腈标准溶液（1 000 mg/L，溶剂：乙腈）和溴代吡咯腈标准品（纯度98.6%）均购于北京振翔科技有限公司。蔬菜和水果样品（甘蓝、茄子、小白菜、韭菜、苹果、柑橘）均为市场购买。

1.2 分析方法

1.2.1 前处理方法分别取1 kg 左右样品，切碎后用食品粉碎机匀浆制备，放入样品罐中，于(－20±2）℃冰柜中保存。

称取（5.0 ± 0.05）g 粉碎均匀的样品于50 mL 塑料离心管中，加入10 mL 乙腈，涡旋提取20 min，再加入5 g NaCl，涡旋30 s，5 000 r/min 离心5 min。吸取4 mL 上清液于50 mL 烧杯中，在50 ℃下氮吹近干。

分别用5 mL乙腈－甲苯（3∶1，体积比，下同）预淋洗NH2固相萃取柱。用5 mL乙腈－甲苯（3∶1）溶解烧杯中的残渣，转入柱中，再用5 mL乙腈－甲苯（3∶1）洗脱并收集，于50 ℃下氮吹近干，用1 mL乙腈定容，经0.22µm微膜过滤，待测。

1.2.2 液相色谱条件色谱柱：岛津Inert Sustain C18（2.1 mm×150 mm，3.0µm）；柱温：40 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：10 µL；检测波长：262 nm（虫螨腈），284 nm（溴代吡咯腈）；流动相：水（A）和甲醇（B）。洗脱条件：0～1 min，30%B；1～5 min，30%～80%B；5～9 min，80%B；9～10 min，80%～30%B；10～14 min，30%B。

1.3 标准曲线、准确度与精密度

称取适量溴代吡咯腈标准品，用乙腈配制为1 002µg·mL-1标准储备液。再与1 000µg·mL-1虫螨腈标准溶液稀释配制成质量浓度分别为25、100、500、1 000、5 000 ng·mL-1的系列溶剂标准工作溶液。按照预定的仪器条件测定，以各组分的峰面积响应值（Y）为纵坐标，其质量浓度（X，ng·mL-1）为横坐标绘制标准曲线。

选择代表性的4种蔬菜（甘蓝、茄子、小白菜、韭菜）和2种水果（苹果、柑橘）为考察基质，分别进行0.05、1、2 mg·kg-13个不同水平的加标回收实验，每个水平重复测定5次，以回收率和相对标准偏差（RSD）分别评价方法的准确度和精密度。

1.4 田间试验

2020年，按照《农作物中农药残留试验准则》（NY/T 788－2018）［11］要求，分别在上海市、山西省、河北省、湖南省、辽宁省、河南省、山东省、安徽省、江西省、广西壮族自治区、贵州省、海南省十二地开展残留田间试验（其中上海市、山西省、河北省、湖南省同时开展动态消解试验）。每个试验设立2个试验小区（100 m2），分别为处理小区和空白对照小区。处理小区按照20 mL/亩（125.28 g a.i./ha），设1 次施药。施药后2 h、7、14、21、28 d 分别随机采集2 个甘蓝样品用于消解残留试验，其中14、21 d的样品作为最终残留试验样品。每次在试验小区内随机采集至少12个（不少于2 kg）生长正常、无病害的甘蓝，装入容器中包扎妥当，粘好标签。小区边行和每行距离两端0.5 m 内不采样。田间样品在采集后，8 h内运回实验室，并立即制备成实验室样品冷冻保存。

甘蓝样品预制备：将甘蓝田间样品切成1 cm 大小的碎块，在不锈钢盆中充分混匀，用四分法缩分样品，于（－20±2）℃冰柜中保存。分析前，用食品粉碎机将甘蓝匀浆。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

虫螨腈可通过液相色谱、气相色谱和气相色谱－串联质谱进行测定［5－8］，而溴代吡咯腈可通过液相色谱、液相色谱－串联质谱进行测定［4，9］。为简化步骤、提高检测效率，参考现有分析方法报道，通过仪器条件优化，本文采用配有二极管阵列检测器的液相色谱仪实现虫螨腈和溴代吡咯腈的同时检测。

首先，分别用甲醇配制10µg·mL－1的虫螨腈和溴代吡咯腈标准工作溶液，在210～400 nm 紫外吸收波长范围进行扫描。结果显示，虫螨腈和溴代吡咯腈分别在262、284 nm 处有较大且稳定的紫外吸收，因此确定虫螨腈和溴代吡咯腈的紫外检测波长分别为262、284 nm。

同时，实验考察了水相流动相固定为水，有机相流动相分别为乙腈或甲醇时的分离效果。结果表明，在“1.2.2”的梯度条件下，当有机相为乙腈时，虫螨腈和溴代吡咯腈的色谱峰分离效果较差，且溴代吡咯腈的峰形较宽，不够尖锐。而以甲醇作为有机相时，2 个化合物的色谱峰分离效果好，且峰形对称尖锐，基线平稳，因此选择甲醇作为有机相。

实验以甲醇为有机相流动相，考察了水相流动相分别为水或0.1%甲酸水时目标化合物的分离效果。结果显示，当水相流动相为水时，目标化合物的仪器响应值较高，峰形对称性好，因此确定流动相为水和甲醇体系。通过调整流动相比例和流速，在“1.2.2”最佳色谱条件下，实现了虫螨腈和溴代吡咯腈的良好分离，其保留时间分别为8.48 min和7.58 min（图1）。

图1 虫螨腈和溴代吡咯腈标准溶液（1µg·mL-1）的色谱图Fig.1 Chromatograms of chlorfenapyr and tralopyril standard solutions（1µg·mL-1）

2.2 前处理方法的优化

作为农药残留分析应用最为广泛的前处理净化方式，固相萃取和分散固相萃取方法对于多种农作物基质具有良好的净化效果［12－13］。选取我国现有标准分析方法［14－18］和文献报道方法［10，19－23］的前处理方式，本文通过配备二极管阵列检测器的超高压液相色谱仪测定甘蓝中虫螨腈及溴代吡咯腈，并通过测定方法回收率和精密度验证前处理方法的适用性。

如表1 所示，除了GB/T 20769－2008 方法［18］和本方法外，其他前处理方法的回收率和RSD 均不能满足同时分析虫螨腈及溴代吡咯腈的要求。采用已有报道中的前处理方法［10］虽能够实现虫螨腈的分析测定（图2A），但对于溴代吡咯腈的定量分析存在严重干扰（图2C），说明采用文献中QuEChERS方法结合质谱检测［10］虽能够实现虫螨腈和溴代吡咯腈的分析要求，但无法满足液相色谱配二极管阵列检测器的检测要求。表明QuEChERS 方法净化效果略差，与文献［24］结论相符。考虑到GB/T 20769－2008 的前处理方法适用于多残留，溶剂用量较大，因此，在保证准确度和精密度的前提下，对萃取溶剂和洗脱溶剂的用量进行了优化。选择3 次5 mL 乙腈－甲苯（3∶1）用于提取和洗脱目标化合物，前处理方法见“1.2.1”，得到虫螨腈和溴代吡咯腈的回收率为84.6%～95.1%，RSD为3.2%～9.1%，且净化效果明显优于QuEChERS方法，完全可以满足残留分析要求（图2B、2D）。

图2 QuEChERS方法（A、C）与氨基固相萃取柱（B、D）的净化效果色谱图Fig.2 Chromatograms of purification effect with QuEChERS（A，C）and NH2 SPE column（B，D）

表1 不同前处理方式下甘蓝中虫螨腈及溴代吡咯腈的回收率和相对标准偏差（1 mg·kg－1，n=5）Table 1 Recoveries and RSDs of chlorfenapyr and tralopyril in cabbage with different pretreatment methods（1 mg·kg－1，n=5）

2.3 线性关系与定量下限

按照“1.3”方法绘制标准曲线，结果表明，虫螨腈和溴代吡咯腈在25～5 000 ng·mL－1质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）分别为0.997和1.000。参照文献［10］，以最低加标水平（0.05 mg·kg－1）为本方法的定量下限。依据我国食品安全国家标准GB 2763－2019 制定的虫螨腈在7 种水果和蔬菜中的最大残留限量（MRL）0.1～10 mg·kg－1［2］，本方法的定量下限（0.05 mg·kg－1）能够满足水果和蔬菜中的检测要求。

2.4 准确度与精密度

按照“1.3”方法以6 种蔬菜和水果为基质进行加标回收实验，结果显示在0.05、1、2 mg·kg－13 个加标水平下，虫螨腈和溴代吡咯腈的回收率为84.6%～111%，RSD 为1.6%～14%（见表2）。表明该方法的准确度和精密度符合我国《农作物中农药残留试验准则》（NY/T 788－2018）要求［11］。

2.5 方法应用

依据我国《农作物中农药残留试验准则》（NY/T 788－2018）［11］要求，2020年开展了甘蓝上360 g·L－1虫螨腈悬浮剂12地田间残留试验，以所构建的方法对甘蓝中虫螨腈及溴代吡咯腈的残留量进行检测。在上海市、山西省、河北省、湖南省4地的残留消解试验结果显示，甘蓝中目标化合物的残留量随着采样时间呈明显下降趋势，符合一级反应动力学方程Ct=C0e－kt［25］。式中，k为降解速率常数；C0为农药的初始含量（mg·kg－1）；Ct为t时刻农药的含量（mg·kg－1）。虫螨腈在甘蓝中的残留量为小于0.05～0.735 mg·kg－1，所有样品中溴代吡咯腈的残留量均低于定量下限（0.05 mg·kg－1）。虫螨腈在山西省、河北省、湖南省甘蓝上的消解半衰期分别为11.0、4.1、5.3 d，上海市甘蓝中虫螨腈的残留数据无法拟合曲线（见表3）。对比相关文献，虫螨腈在甘蓝上的半衰期（2.2～16.5 d）［26-27］与本文所得的半衰期（4.1～11.0 d）较一致，而由于气候、作物、土壤中微生物菌群等因素，不同产地甘蓝中虫螨腈的半衰期差别较大。

表3 虫螨腈在甘蓝中的动态消解Table 3 Dissipation dynamic of chlorfenapyr in lettuce

表4 数据显示，当采样间隔期为14 d 时，甘蓝上虫螨腈的残留量为小于0.05～0.488 mg·kg－1；残留中值（STMR）为0.05 mg·kg－1，残留最大值（HR）为0.488 mg·kg－1；溴代吡咯腈的残留量均低于定量下限（0.05 mg·kg－1）；根据JMPR报告［3］中虫螨腈的膳食风险评估定义，甘蓝中虫螨腈（膳食风险评估定义）的残留量为小于0.55～0.988 mg·kg－1，残留中值为0.55 mg·kg－1，残留最大值为0.988 mg·kg－1。根据我国食品安全国家标准GB 2763－2019［2］设定虫螨腈在甘蓝中的最大残留限量1 mg·kg－1，本文推荐360 g·L－1虫螨腈悬浮剂在甘蓝上的采收间隔期为14 d。

表4 虫螨腈和溴代吡咯腈在甘蓝中的最终残留Table 4 Final residues of chlorfenapyr and tralopyril in lettuce

根据食品安全国家标准GB 2763－2019，虫螨腈的每日允许摄入量（ADI）为0.03 mg/kg bw［2］。目前，我国虫螨腈的登记作物包括韭菜、甘蓝、芥蓝、小白菜、大白菜、茄子、黄瓜、节瓜、豇豆、豆角、姜、柑橘、苹果、梨、茶叶。根据我国现有的最大残留限量以及膳食风险评估作物分类，选择普通白菜（参考中国限量10 mg/kg［2］）、姜（参考韩国限量0.1 mg/kg［28］）、苹果（参考澳大利亚限量0.5 mg/kg［29］）、茶叶（参考中国限量20 mg/kg［2］），结合我国人均膳食结构，按照长期摄入计算虫螨腈的膳食风险。普通人群虫螨腈（膳食风险评估定义）的国家估算每日摄入量为1.28 mg，占日允许摄入量的67.7%。表明虫螨腈对一般人群健康不会产生不可接受的风险［30］。

3 结 论

本文建立了采用固相萃取净化和超高压液相色谱同时测定水果和蔬菜中虫螨腈及其代谢物溴代吡咯腈残留量的分析方法，该方法简单、高效、准确，方法验证结果符合我国《农作物中农药残留试验准则》（NY/T 788－2018）要求［11］。田间残留试验结果表明，虫螨腈在甘蓝中的降解趋势符合一级动力学方程，半衰期为4.1～11.0 d。当样品采收间隔期为14 d 时，甘蓝中虫螨腈、虫螨腈（膳食风险评估定义）的残留中值分别为0.05、0.55 mg·kg－1，残留最大值分别为0.488、0.988 mg·kg－1；溴代吡咯腈的残留量均低于定量下限（0.05 mg·kg－1）。膳食风险评估结果显示，虫螨腈（膳食风险评估定义）的国家估算每日摄入量为1.28 mg，占日允许摄入量的67.7%，表明对居民健康不会产生明显影响。本文研究结果为360 g·L－1虫螨腈悬浮剂的合理使用以及膳食风险评估提供了基础数据。