萘乙酸多孔磁性分子印迹聚合物微球的制备

谈晓佩，李珊珊，石海珠，张纯姑*，封 顺*

（1.西南交通大学 生命科学与工程学院，四川 成都 610031；2.乌鲁木齐市第十五中学，新疆 乌鲁木齐 830046）

萘乙酸（α-Naphthylacetic，NAA）是一种广谱、高效的植物生长调节剂，具有促进植物生根、抽芽、开花，防止落花落果，促进果实成熟和增产等调节作用，广泛用于小麦、水稻、棉花、番茄等农作物中［1］。NAA 具有神经毒性和急性毒性，其在农作物中的残留进入人体后可使人的生殖和发育受损，甚至导致癌症［1－3］。因此许多国家和组织将NAA 列入限制使用的农药名单。我国（GB 2763－2019［4］）和欧盟（EC 396/2005［5］）分别规定NAA在食品中的最大残留限量（MRL）为100µg·kg－1和60µg·kg－1。

针对NAA 的测定，目前已发展了荧光分光光度法［6－7］、气相色谱法［8－9］、高效液相色谱法（HPLC）［10－13］、色谱－质谱联用［14－17］等技术。但由于NAA 的残留量相对较低，且样本基质复杂，为提高检测结果的可靠性和准确性，实现高通量分析，开发新的样本前处理技术具有实际应用价值。

分子印迹聚合物（Molecular imprinted polymers，MIPs）对待测化合物具有特异性识别能力，兼具实用性高、分离速度快、制备方便等优点，近年来被广泛应用于天然产物、食品、生物和环境样品中目标化合物的选择性识别［18－22］。NAA 的分子印迹聚合物目前也得到了应用，但其制备步骤繁琐、耗时［23－24］。

本文将磁分离技术引入MIPs 中，发展了一种无皂液乳化技术制备NAA 磁性分子印迹聚合物多孔微球的方法。以甲基丙烯酸－苯乙烯聚合物前驱体为功能单体，NAA为模板分子，与Fe3O4磁流体和引发剂偶氮二异丁腈混合，采用“一锅法”快速制得NAA－mMIPs 微球。该制备方法简便、快捷，同时赋予微球多孔结构，有利于提高传质速率，增加实际结合位点数量。

1 实验部分

1.1 试剂、仪器与色谱条件

萘乙酸（C12H10O2，分析纯）购于上海阿拉丁试剂有限公司；硫酸亚铁铵（（NH4）2SO4·FeSO4·6H2O）、甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）、氯仿（CHCl3）、乙酸（HAc）购于天津市永盛精细化工厂；甲基丙烯酸（MAA）、偶氮二异丁腈（AIBN）购于天津市光复精细化工研究所；苯乙烯（St）、油酸（OA）、氢氧化钠（NaOH）、环己烷（C6H12）购于天津市富宇精细化工有限公司；番茄购自乌鲁木齐当地超市。实验用水为超纯水。

采用LEO 1430VP 扫描电子显微镜（SEM，德国LEO 电镜有限公司）、H－600 透射电子显微镜（TEM，日本日立公司）、Presti－21傅里叶变换红外光谱仪（FT－IR，日本岛津公司）对微球形貌、红外光谱数据进行表征。

LC－10Atvp HPLC（日本岛津）由LC－10Atvp二元泵和SPD－10Avp检测器组成。色谱条件如下：色谱柱OptimaPak C18柱（150 mm×4.6 mm，5µm），进样量20µL；流动相为甲醇－0.2%乙酸水溶液（体积比1∶1），等度洗脱，流速1.0 mL·min－1，检测波长280 nm。分析前所有样品需用0.45µm微孔膜过滤。

1.2 实验条件

1.2.1 Fe3O4磁流体的制备Fe3O4磁流体的制备参考本实验室之前的工作［25］：将10 mL 0.2 mol·L－1（NH4）2SO4∙FeSO4∙6H2O 溶液在搅拌下加入30 mL 0.1 g·mL－1NaOH/EtOH/OA（1∶1∶1，体积比）溶液；于40 mL 聚四氟乙烯反应釜中180 ℃反应10 h；待其自然冷却至室温，取出沉淀；用10 mL 环己烷和30 mL EtOH连续洗涤，重复3次。最后将得到的产物分散于4 mL CHCl3中，储存，备用。

1.2.2 聚合物前驱体的合成将0.4 mL MAA、10.0 mL St和0.2 g AIBN 加入60 mL CHCl3中，混合均匀后，100 ℃反应10 h。冷却至室温，加入120 mL CH3OH，离心，收集沉淀；用20 mL CHCl3洗涤3次，以除去未反应的单体；60 ℃真空干燥12 h，即得poly（St－co－MAA）前驱体［23］。

1.2.3 磁性分子印迹聚合物的制备将300µL磁流体、1 mmol·L－1NAA 水溶液和0.524 6 g聚合物前驱体依次加入4 mL CHCl3中，混合均匀后，于搅拌下缓慢加入10 mL 0.1 g·mL－1NaOH 水溶液；70 ℃反应2 h，自然冷却至室温后磁分离；依次用1 mL MeOH、含10%（体积分数）HAc 的MeOH 溶液洗涤。60 ℃真空下干燥，即得产物NAA 磁性分子印迹聚合物（mMIPs）。同时，不添加模板分子NAA，平行制备了磁性非印迹聚合物（mNIPs）。

1.2.4 吸附性能等温吸附实验：将10 mg mMIPs 或mNIPs 分散于2 mL 质量浓度1～100 µg·mL－1的NAA 标准溶液中，室温振荡3 h，磁分离；采用标准曲线法，利用UV－Vis 在280 nm 处测定吸附前后溶液中NAA的质量浓度。

吸附动力学实验：将10 mg mMIPs 或mNIPs分散于2 mL 50µg·mL－1的NAA 标准溶液中，按一定时间间隔（5、15、30、60、90、120、180 min）收集上清，利用UV－Vis 在280 nm 处测定溶液中NAA 的质量浓度。

1.2.5 实际样本检测将乌鲁木齐当地超市购买的番茄洗净后，榨汁，过0.45µm 微孔膜。分别加入NAA 标准溶液配制最终质量浓度分别为0.005、5、15、25 µg·mL－1的加标液。加入10 mg mMIPs，孵育90 min；磁分离后，用1 mL MeOH－HAc（9∶1，体积比）洗脱捕获的NAA，重复3 次。合并洗脱液，真空干燥后，以100µL流动相复溶，过膜后，进行HPLC分析。其中0.005µg·mL－1加标样本的样本量为2 mL。

以上实验均重复3次。

2 结果与讨论

2.1 NAA－mMIPs的表征

从TEM 图可以发现，Fe3O4磁流体粒径在5～30 nm 之间（图1A）。SEM 图显示，NAA－mMIPs 粒径为80µm，微球呈多孔结构，孔洞均匀分布，直径约1～10µm（图1B）。该多孔结构使得微球具有较大的比表面积，同时显著增加了可接触识别位点数量，有利于增大柱容量，提升传质速率。在图1C 中，曲线a（Fe3O4）578 cm－1处的峰为Fe3O4的Fe—O 特征峰。曲线b（poly（St－co－MAA）前驱体）中，750、830、1 500、1 580 cm－1处均为poly（St－co－MAA）中苯环的特征峰；1 697 cm－1处为C====O 红外吸收峰，2 800 cm-1和3 000 cm－1处的峰可归属为—CH3的伸缩振动，3 400 cm－1处为—OH的伸缩振动。而在曲线c 中，可同时观察到上述官能团（Fe—O、苯环、C====O、—CH3、—OH）的红外特征吸收峰，表明NAA－mMIPs 被成功制备。同时该微球具有良好的磁响应性，在外加磁场作用下，可在30 s 内实现液固分离（图1D）。

图1 Fe3O4的TEM图（A），NAA－mMIPs的SEM图（B）、FT－IR光谱图（C）、磁分离图（D）Fig.1 TEM image of Fe3O4（A），and SEM（B），FT－IR（C），magnetic separation image（D）of NAA－mMIPs a.Fe3O4，b.poly（St－co－MAA）precursor，c.mMIPs

2.2 等温吸附性能测试

依据等温吸附实验结果，以方程（1）计算NAA在mMIPs和mNIPs上的吸附量（Q，mg·g－1）：

式中：C0（µg·mL－1）表示模板分子的初始质量浓度；Ct（µg·mL－1）表示吸附后上清液中模板分子的质量浓度；m（g）表示聚合物的质量；V（mL）表示所取模板分子溶液的体积。从图2A 可以发现，随着NAA 初始质量浓度的增加，mMIPs 对模板分子的结合量增加。同时，mMIPs 在所有浓度下的吸附量均显著高于mNIPs。说明MNIPs 对NAA 的吸附是由非特异性相互作用引起的。

采用Scatchard方程（式2）进一步对其吸附性能进行分析：

式中：Q（mg·g－1）为mMIPs 对模板分子的平衡结合量；C（µg·mL－1）为溶液中模板分子的平衡质量浓度；Qmax（mg·g－1）为结合位点的最大表观结合量；Kd（µg·mL－1）为结合位点的平衡解离常数。从图2B中可以看出，mMIPs的Scatchard图由两条斜率不同的直线组成，说明mMIPs对NAA 的结合存在高和低两种亲和位点，拟合所得线性方程分别为y=－6.200 × 10－3x+ 0.182 0（r2= 0.995 5）和y= 7.800 ×10－3x+0.152 1（r2=0.968 8）。由斜率和截距可得高、低亲和位点的解离常数和最大表观结合量分别为161.30 µg·mL－1、29.35 mg·g－1以及－128.20 µg·mL－1、－19.50 mg·g－1。对于mNIPs，其Scatchard图中仅有一条曲线（图2C），说明NAA－mNIPs与NAA 的结合只有一种形式，线性方程为y=－1.629×10－2x+0.075 88，解离常数Kd=61.39µg·mL－1，最大表观吸附量Qmax=4.658 mg·g－1。上述结果表明mMIPs 存在着特异性和非特异性吸附，但特异性吸附要远强于非特异性吸附；而mNIPs 对NAA 的吸附没有选择性，仅存在着非特异性吸附。

图2 mMIPs和mNIPs等温吸附曲线（A），mMIPs（B）和mNIPs（C）的Scatchard曲线Fig.2 The adsorption isotherms of mMIPs and mNIPs（A），Scatchard plots of mMIPs（B）and mNIPs（C）

2.3 动力学吸附性能测试

动力学吸附实验结果见图3。由图3A可知，mMIPs在120 min时基本达到吸附平衡。分别采用伪一级动力学模型（式3）和伪二级动力学模型（式4）对吸附数据进行拟合：

图3 mMIPs和mNIPs吸附动力曲线（A），mMIPs和mNIPs的伪一级（B）和伪二级（C）动力学模型Fig.3 The adsorption curves of mMIPs and mNIPs（A），the pseudo-first-order（B）and pseudo-second-order（C）kinetic models of mMIPs and mNIPs

式中：Qe（mg·g－1）和Qt（mg·g－1）分别为达到吸附平衡和在时间t时的吸附量；k1（min）和k2（g·mg－1·min－1）分别为伪一级和伪二级动力学吸附速率常数。由表1 可以看出，mMIPs 和mNIPs 对NAA的吸附更吻合伪二级动力学模型，化学吸附为决速步。

表1 NAA－mMIPs及NAA－mNIPs的动力学模型结果Table 1 The experimental results of absorption kinetics of NAA－mMIPs and NAA－mNIPs

2.4 方法学考察

首先建立了HPLC测定NAA的标准曲线，其在1～100µg·mL－1范围内线性关系良好，r2为0.999 8，说明该HPLC方法可应用于NAA的准确定量。分别配制NAA最终质量浓度为5、15、25µg·mL－1的番茄汁加标溶液，取2 mL 经mMIPs 处理后，采用优化的HPLC 条件对洗脱液进行分析，得到其平均回收率为78.7%～89.2%，相对标准偏差（RSD，n=3）小于3.9%，表明方法重现性良好。进一步将mMIPs应用于番茄汁中质量浓度低至0.005µg·mL－1的NAA的富集，由图4可见，番茄汁、加标番茄汁、上清液对应的色谱图中均无NAA 色谱峰，而在洗脱液中能够清晰观察到NAA 的色谱峰，且其平均回收率高达80.3%（RSD<5.0%，n=3）。该NAA测定值（0.005µg·mL－1）远低于国标［4］或欧盟标准［5］规定的最大残留限量。上述实验结果证实所制备的mMIPs对NAA表现出优异的选择性和特异性，能够有效消除复杂基质的影响，对实际样本中痕量NAA的测定结果具有高准确性和可靠性。

图4 番茄汁原液（A）、加标液（B）、mMIPs处理后的上清液（C）和洗脱液（D）的色谱图Fig.4 Chromatograms of initial sample（A），spiked sample（B），the supernatant after treated with the mMIPs（C）and the eluent（D）

3 结 论

本文将Fe3O4磁流体、poly（St－co－MAA）共聚物、NAA 和CHCl3混合，成功制备了NAA 多孔结构mMIPs，并采用多种方法研究了吸附剂的形态和吸附行为。方法简便，制备的NAA－mMIPs 拥有多孔结构和良好的超顺磁性，同时对NAA 表现出高的识别能力。实际样品测定表明，mMIPs可实现复杂食品中微量NAA的高效富集。