杭白菊CmbHLH96的克隆及生物信息分析

何子涵， 张佳凝， 全英杰， 任镘蓉， 杨雯婷， 高 日

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)转录因子广泛存在于植物中，在植物生长发育过程中起重要作用[1]。bHLH转录因子包含保守的bHLH结构域，由1个位于N端的碱性区域(Basic rigion)和1个位于C端的α螺旋1-环-α螺旋2(helix-loop-helix)结构组合而成。Toeldo等[2]将拟南芥中的162个bHLH转录因子划分为21个亚家族，Li等[3]将水稻中的167个bHLH转录因子分为22个亚家族。将植物白杨、苔藓及藻类与拟南芥、水稻等进行系统发育分析比较，可分为32个亚家族[4]。bHLH蛋白参与调控植物中类黄酮、生物碱、萜类等物质合成[5]。在模式植物拟南芥中过表达bHLH转录因子AtTT8和AtEGL3，可以提高类黄酮的含量[6]，在银杏中，GbbHLH91过表达可以调控黄酮合成途径中的前期基因，从而提黄酮含量[7]。玉米bHLH类转录因子LC通过与R2R3-MYB转录因子C1形成MYB-bHLH复合体共同调控黄酮醇合成[8]。在石斛花瓣中DhbHLH1和DhMYB2互作，共同参与调控花色苷的合成[9]。转录因子bHLH也可与MYB和WD40 3类转录因子相互作用形成MBW 3元复合物来调控类黄酮的生物合成[10]。拟南芥MBW复合物直接参与花青素晚期生物合成基因(LBGs)的表达。bHLH在甘蓝、郁金香、矮牵牛等植物中已经报道参与调控黄酮类化合物合成[11-13]，但在杭白菊还未见报道。

杭白菊(Chrysanthemummorifolium)为菊科菊属植物，花中含有绿原酸、木樨草苷、地奥司明、香叶木素等黄酮类化合物，是中草药的有效成分，具有清除自由基、抗氧化、调血脂、保护心血管和降血压等功效[14-16]。同时，杭白菊也是一种药食同源的茶用菊，深受人们的喜爱。人们对药用菊、食用菊更加重视内在质量优劣，育种向着多品种、高要求的方向发展[17-18]。近些年来，由于多代扦插繁殖引起种质退化，影响杭白菊品质下降，而bHLH96基因可能参与黄酮类化合物的合成过程提升杭白菊品质。因此，该研究以杭白菊为材料，通过克隆bHLH96转录因子，用生物信息学分析其结构特点、理化性质及预测与其结合的miRNA，为bHLH96基因功能验证提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

杭白菊试管苗培养30 d后，选取试管苗叶片作为实试材料。

1.2 RNA提取及CmbHLH96的克隆

取杭白菊顶端2～3片叶，Trizol法提取其总RNA，利用反转录试剂盒(Tiangen)，根据说明书的方法合成cDNA第1链，在-20 ℃的条件下保存备用。根据bHLH转录因子的保守序列，在转录组数据库中搜索同源序列。利用Primer 5.0软件设计特异引物CmbHLH96-F: TTTGGTTTCTTTAGGGTTCA与CmbHLH96-R: ATCATCATAAGGCACAGGGT,进行PCR扩增，反应程序为：变性94 ℃，30 s，退火温度58 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s；35个循环。琼脂糖凝胶电泳，切取特异片段，利用琼脂糖凝胶试剂盒回收片段，连接到pMDT19载体上，转化到大肠杆菌DH5α菌株，送南京斯普金生物科技有限公司测序。

1.3 CmbHLH96蛋白质二级结构三级结构预测

用PredictProtein(https://predictprotein.org/)预测CmbHLH96蛋白质二级结构，采用SWISS-MODEL在线软件预测杭白菊CmbHLH96蛋白三级结构。

1.4 CmbHLH96蛋白的理化性质

利用NCBI CD-Search分析CmbHLH96蛋白的保守结构域，利用ExPASy在线网站预测CmbHLH96蛋白的分子量、等电点、不稳定系数、脂肪指数及疏水性等。

1.5 转录因子CmbHLH96的miRNA预测

使用在线工具psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/? function=2)，对miRNA进行靶标预测。

1.6 CmbHLH96系统进化树分析

下载bHLH同源基因序列，利用DNAMAN软件进行多重序列比对；运用MEGA7.0构建NJ (neighbor-joining)树，缺口设置complete deletion，模式为p-distance，校验参数Bootstrap为1 000次

2 结果与分析

2.1 RNA提取及CmbHLH96克隆与分析

以杭白菊叶片为材料，采用Trizol法提取总RNA，可见28 S，18 S和5 S条带清楚，可以用于基因克隆(图1)。利用FastQuant cDNA第1链合成试剂盒将mRNA反转录成cDNA。根据杭白菊基因组数据(http://www.amwayabrc.com/)中获得的bHLH96(CHR00001268) 片段序列，设计保守片段引物进行PCR扩增，凝胶电泳发现在1 000 bp左右有1条明显亮带(图2)。

CmbHLH96基因最大开放阅读框(ORF) 918 bp，编码306个氨基酸序列。通过利用NCBI数据库进行BLAST比对，下载与CmbHLH96蛋白同源性较高物种氨基酸序列。通过DNAMAN软件对同源序列进行多重对比，发现青蒿(PWA87571.1)、除虫菊(GEU45887.1)、向日葵(XP_021987138.1)、洋蓟(XP_024977049.1)和莴笋(XP_023771628.1)都含有1个helix-loop-helix domian (HLH)结构功能域(图3)。

2.2 CmbHLH96蛋白的理化性质分析

通过ExPASy网站预测,CmbHLH96相对分子量1 121.74 KD，等电点5.06，不稳定系数35.95，CmbHLH96蛋白的总平均亲水性0.75，脂肪指数33.65，亚细胞定位预测表明,CmbHLH96定位于细胞核中(表1)。预测表明CmbHLH96蛋白可能是一个定位在细胞核中的稳定的酸性亲水性蛋白。

表1 CmbHLH96蛋白理化性质分析Table 1 Physicochemical properties of CmbHLH96 protein

2.3 CmbHLH96蛋白质二级、三级结构预测

蛋白质的氨基酸组成决定了蛋白的功能。用PredictProtein (https://predictprotein.org/)预测蛋白质二级结构，分析显示：杭白菊CmbHLH96蛋白二级结构(表2)主要为α螺旋，无规则卷曲和延伸链，分别占25.82%、14.71%、59.48%。采用SWISS-MODEL在线软件预测杭白菊CmbHLH96蛋白三级结构(图4)显示，该蛋白主要由α-螺旋和延伸链组成，与二级结构预测结果一致。

表2 CmbHLH96 蛋白二级结构的预测

2.4 CmbHLH96的miRNA预测

利用psRNATarget数据库，对CmbHLH96的miRNA进行预测(表3)。预测结果显示，CmbHLH96基因可能受miR7696调控，miRNA7696序列为AUUAAGUUCUAAUAAUUUAA，与CmbHLH96的作用位点在1 165～1 184 bp。

表3 miRNA的靶标预测

2.5 CmbHLH96系统发育树分析

为研究CmbHLH96与不同种属植物家族的关系，通过在NCBI核酸序列库进行检索，下载同源性较高的不同种属蛋白质序列行比对分析，并使用MEGA 7.0软件构建CmbHLH96系统进化树(图5)，CmbHLH96与菊科蒿属青蒿亲缘关系较近，推测CmbHLH96基因可能与青蒿的bHLH基因家族功能相近。

青蒿AabHLH(PWA87571.1)、向日葵HabHLH94 (XP_021987138.1)、烟草NsbHLH94-like(XP_009781858.1)、洋蓟CcbHLH94-like(XP_024977049.1)、棉GsbHLH(MBA0866875.1)、番茄SlbHLH94-like(XP_004237957.1)、拟南芥AtbHLH94(XP_028052116.1)、拟南芥AtbHLH96、木瓜LtbHLH96-like(XP_031114478.1)、山茶CsbHLH96-like(XP_028052116.1)、猕猴桃AcbHLH96-like(PSS31608.1)、莴苣LsbHLH96 (CAB4103592.1)、甘薇菊MmE3N88(KAD5507496.1)、番薯LnbHLH96-like(XP_019174067.1)。

3 讨论与结论

杭白菊是4大药用名菊，具有丰富的黄酮成分，是药用植物的主要活性成分之一[19]。bHLH是黄酮合成过程中的重要基因，其作用是在类黄酮合成途径中与MYB和WD40蛋白相互作用，bHLH作为中间桥梁将3者连接形成MBW复合物，复合体结构MBW与启动子结合激活黄酮类化合物合成结构基因的表达来调控类黄酮物质的代谢[20-21]。葡萄vMYCl基因、猕猴桃AdGL3、棉花GhbHLH106-A等bHLH基因过表达可以促进类黄酮物质含量的积累[22-24]。在月季、红梨等植物中详细报道过bHLH与MYB、WD形成MBW过程的互作机制[25-26]。bHLH96是一种未知功能的基因，目前的研究中并未有相关报道。通过该试验研究系统进化树发现，CmbHLH96与青蒿、向日葵等菊科植物亲缘关系相近，在青蒿中bHLH基因家族中的MYC2、bHLH1、HD1、HD8参与调控青蒿素(倍半萜内酯类化合物)合成途径中的关键酶基因[27-30]，所以推测CmbHLH96可能具有相似功能。

miRNA分子通过碱基配对与靶mRNA结合从而在转录后引起靶mRNA的剪切或翻译的抑制，从而影响蛋白质的表达[31]。在植物中miRNA可参与黄酮类化合物合成过程中bHLH基因的表达，如novel 87调控bHLH74的表达，进而影响类黄酮的积累[32]。该研究预测miRNA7696可能调控CmbHLH96基因表达，影响黄酮类化合物的合成，合成机制有待研究。