贯叶连翘不定根不同溶剂提取物的抗氧化活性研究

刘懿萱， 徐亚男， 孙浩丁， 廉美兰， 朴炫春

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

贯叶连翘(Hypericumperforatum)，又名小汗淋草、过路黄，西方称为圣约翰草，是藤黄科金丝桃属的一种多年生草本植物，多产于我国新疆、山东、江苏、江西等地，成熟全草可用药，且具有悠长的药用历史[1-3]。现代医学研究表明，贯叶连翘具有很多药理作用，如抗肿瘤、抗病毒、防衰老、抗抑郁、护肝等作用，已成为全球研究开发的热点药材之一[4-7]。因贯叶连翘的广泛应用前景，近些年它的需求量急剧增加，导致其野生资源破坏，栽培产量和质量满足不了市场需求。因此，国内外的研究学者不断地寻找保护开发资源的方法，其中,利用植物组织培养方法短期内大量生产植物材料是缓解贯叶连翘资源问题的有效途径。研究表明，植物不定根培养与植物细胞或其它器官培养相比优势明显[8-9]，且拥有原始植物根本身所具有的强大生物合成能力，同时可以表现出相对稳定的代谢活力[10]。

现代科学研究指出，过量自由基的产生往往与许多的慢性病和衰老紧密相关[11]。抗氧化可以有效减轻其所带来的危害程度，所以抗氧化相关产品的开发已成为医疗行业和化妆品企业主要研发方向之一[12]。天然植物抗氧化剂具有良好的抗氧化效果，且具有毒副作用小，安全性高，活性成分含量高等优点[13-14]。目前，已发现，植物器官培养物同样具有很好的抗氧化活性。如，李慧娟等[15]发现，刺参不定根有明显高于栽培植株的DPPH自由基清除能力；吕世鑫等[16]发现，西洋参不定根提取物具有强大的抗氧化活性。另外，研究发现不同溶剂提取不定根提取物的抗氧化活性有很大差异，如高原等[17]发现，软枣猕猴桃不定根乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇和水提取物中，乙酸乙酯提取物有最好的抗氧化效果；张声源等[18]发现，虎舌红乙酸乙酯提取物的还原能力和清除自由基的能力强于石油醚、正丁醇及水提取物。抗氧化活性的评价方法有多种，如DPPH自由基清除活性测定、ABTS自由基清除活性测定以及铁离子螯合能力测定，但针对不同评价方法确定抗氧化能力时，需要一种方法对抗氧化综合能力进行整体评价。层次分析法是美国运筹学家匹茨堡大学教授萨蒂提出的一种层次权重决策分析方法，该方法是将定量分析与定性分析相结合，使不同指标的权重系数确定在一定范围内，避免了主观因素对赋予权重系数的影响，利用权数求出各方案的优劣次序，具有强大的科学客观性，可以有效解决难以定量分析的问题。层次分析法通常被广泛应用于安全科学研究，且近年来，层次分析法也逐步应用于中药提取工艺的综合评价[19-20]。但在生物活性评价方面应用很少，因此，该试验用正丁醇、甲醇、乙醇和水对贯叶连翘不定根进行提取，对4种不同溶剂提取物的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和铁离子螯合能力进行测定，进而利用层次分析法对抗氧化能力进行综合评价，为贯叶连翘不定根提取物作为天然抗氧化剂的深入研究以及相关抗氧化产品的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

贯叶连翘不定根按照于晓坤[21]的方法进行增殖培养。取20 g增殖后生长状态良好的贯叶连翘不定根(鲜重)，切碎成1 cm大小后接种到装有4 L培养液(Murashige and Skoog Medium + 吲哚丁酸1.2 mg/L+蔗糖40 g/L)的5 L生物反应器中培养，调节pH值至5.8，暗培养，通气量为0.1 vvm，控制温度在(25±2) ℃，培养30 d后，取出培养好的贯叶连翘不定根用水冲洗3～4次，沥干表面水分，放入45 ℃烘干箱中，烘干的植物干品用作试验材料。

1.2 试剂与仪器设备

Murashige and Skoog Medium(MS，索莱宝公司，中国)，吲哚丁酸(IBA，上海源叶生物科技有限公司，中国)，过硫酸钾(K2S2O8，科密欧公司，中国)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma公司，美国)，抗坏血酸(Vc，索莱宝公司，中国)，2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，索莱宝公司，中国)，氯化亚铁(FeCl2·2H2O，索莱宝公司，中国)。

YHW1103远红外快速干燥箱(长沙联申恒温有限公司)；JY2003电子天平(西安研硕仪器设备有限公司)；UV1102紫外可见分光光度计(北京格瑞恩科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 贯叶连翘不定根提取物的制备

取干燥的贯叶连翘不定根2 g，置于150 mL三角烧瓶内，利用正丁醇、甲醇、乙醇和水4种不同溶剂按液料比30∶1在温度60 ℃和60 kHz为频率的超声波中进行提取[17]，经过1 h后过滤，重复上述提取操作4次，合并滤液，将滤液置于旋转蒸发仪内真空浓缩，将浓缩后的膏状物置于烘干箱中45 ℃下干燥至恒重，收集烘干后的不同溶剂提取物，置于-20 ℃冰箱中保存，对待测定提取物中总黄酮含量以及抗氧化活性进行评估。

1.3.2 贯叶连翘不定根不同溶剂提取物中总黄酮含量的测定

采用李伟等[22]方法测定总黄酮含量。准确称取10 mg芦丁标准品至烧杯内，用70%的乙醇溶液充分溶解并定容至250 mL，分别吸取芦丁标准液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，用70%的乙醇溶液定容至2 mL，以70%乙醇为空白对照，每间隔6 min分别加入0.3 mL的NaNO2(5%)溶液、0.3 mL的Al(NO3)3(10%)溶液和2 mL的NaOH(4%)溶液，摇匀并在510 nm下测量OD值，绘制标准曲线。

分别准确称取0.1 g不同溶剂提取物于离心管中，加70%的乙醇溶液没过材料，置于60 ℃水浴锅加热3 h后进行过滤，过滤后的溶液用70%乙醇溶液将其定容至25 mL，每个样品液取0.05 mL于试管中，用70%的乙醇定容至2 mL后，按标准曲线步骤操作，测定吸光值，并计算总黄酮的含量。

总黄酮含量/(mg·g-1)=CVD/W,

式中,C为样品溶液浓度/(mg·g-1)；V为样品溶液总体积/mL；D为样品稀释倍数；W为样品的质量/g。

1.3.3 贯叶连翘不定根不同溶剂提取物抗氧化活性的测定

1) DPPH自由基清除活性的测定

参照李钊等[23]的方法进行DPPH自由基清除试验，并稍作改进。分别精密称取4种不同溶剂提取物40 mg定容至20 mL，样品浓度2.0 mg/mL，将上述溶液依次稀释至浓度为0.0125、0.025、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL的待测样品溶液，Vc作为阳性对照。称取0.003 9 g的DPPH，用甲醇溶液定容至100 mL，即DPPH溶液浓度为0.1 mM。向试管中加入2 mL的待测样品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液，设为待测样品组。空白对照组用2 mL甲醇代替待测样品。避光静置30 min，用紫外分光光度计在517 nm下测定吸光值OD，按照下述公示计算出DPPH自由基清除率。

式中，OD样为待测样品组吸光值，OD空为空白对照组吸光值。

2) ABTS自由基清除活性的测定

参照吴冕等[24]的方法进行ABTS自由基清除试验，对4种不同溶剂提取物清除ABTS自由基的能力进行测定。用去离子水配置2.45 mmol/L的过硫酸钾和7 mmol/L的ABTS混合溶液，并经过一定的配置成储备液。试验前需用去离子水将ABTS储备液的吸光值稀释至在734 nm下为0.70±0.02。称量选取50 mg 4种不同溶剂提取物，溶于5 mL的去离子水中，溶液浓度为10 mg/mL。将以上溶液分别稀释至浓度为0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL的待测样品溶液。待测样品组取待测样品溶液(0.1 mL)和ABTS溶液(3.9 mL)于试管中。待测样品对照组取待测样品溶液(0.1 mL)和去离子水(3.9 mL)于试管中。空白对照组向试管中加入甲醇溶液(0.1 mL)和ABTS溶液(3.9 mL)，Vc作为阳性对照。摇匀后静置6 min，用紫外分光光度计测得吸光值(734 nm)，按照下述公示计算出ABTS自由基清除率。

式中，A样为待测样品组吸光值，A对为待测样品对照组吸光值，A空为空白对照组吸光值。

3) 铁离子螯合能力的测定

参照Fu等[25]的方法并稍作改进，对4种不同溶剂提取物的铁离子螯合能力进行测定。称取4种不同溶剂提取物100 mg溶于5 mL的蒸馏水中，溶液浓度为20 mg/mL。将上述溶液依次稀释至浓度为0.625、1.25、2.5、5.0、10.0和20.0 mg/mL的待测样品溶液，柠檬酸作为阳性对照。按照表1准确吸取待测样品溶液、蒸馏水、FeCl2溶液、菲洛嗪溶液于96孔板中，于室温中静置10 min。用酶标仪在562 nm处测吸光值，并计算出铁离子螯合能力。

表1 反应液的组成

式中，A样为待测样品组吸光值，A对为待测样品对照组吸光值，A空为空白对照组吸光值。

1.3.4 抗氧化能力综合评价模型构建

根据Jensen[26]方法进行层次分析法。图1为层次分析法结构模型，由目标层和标准层构成，其中,目标层为抗氧化能力，标准层分别为DPPH自由基清除能力(f1)、ABTS自由基清除能力(f2)和铁离子螯合能力(f3)。

表2为各指标成分的评分标准[27]，对不同抗氧化能力进行两两比较后主观评价出相对重要性。

表2 各指标评分标注

根据公式(1)建立不同抗氧化能力成对比较的优先判断矩阵(N)并进行一致性检验，并利用公式(2)计算出初始权重(Wi'),利用公式(3)计算出归一化权重(Wi)。

(1)

(2)

(3)

根据公式(4)计算出判断矩阵的最大特征值(λmax)与，根据公式(5)计算出一致性指数(CI)，利用公式(6)计算出CI的成对矩阵的一致性比率CR，并利用随机一致性指数RI(表3)评估矩阵合理性。最后利用公式(7)和3种抗氧化评价中的半数有效浓度(EC50)计算出综合评分S[28]。根据S值综合评价抗氧化活性。

表3 随机一致性指数

(4)

(5)

(6)

(7)

1.3.5 数据分析

利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)中的方差分析程序分析试验数据，用邓肯氏新复极差法作对比，显著水平为P<0.05，每个处理均进行3次重复试验。

2 结果与分析

2.1 贯叶连翘不定根不同溶剂提取物中总黄酮含量

贯叶连翘不定根4种不同溶剂提取物中总黄酮含量差异显著。甲醇提取物中的总黄酮含量最高，达到296.31 mg/g，乙醇和正丁醇提取物中的总黄酮含量无显著差异，当提取溶剂为水时，贯叶连翘不定根的总黄酮含量仅有45.73 mg/g(图2)。

2.2 贯叶连翘不定根不同提取溶剂的抗氧化活性

2.2.1 清除DPPH自由基能力

由图3可知，4种不同溶剂提取物对DPPH自由基都有显著的清除能力。其中，甲醇提取物表现出最高的清除能力，当浓度为0.40 mg/mL时，清除率最高达到了93.36%。乙醇提取物和正丁醇提取物清除能力较甲醇提取物稍低，在浓度为0.40 mg/mL时，清除率为92.38%和86.77%，而水提物最弱。

2.2.2 清除ABTS自由基能力

由图4可知，ABTS清除率随提取物浓度(0～1.0 mg/mL)的增加而上升。乙醇提取物有最强的ABTS自由基清除能力，当浓度为4.0 mg/mL时，清除率达到99.12%，但比阳性对照Vc的清除能力(100%)稍低。甲醇提取物对ABTS自由基清除能力稍弱于乙醇提取物，当浓度为4.0 mg/mL时，清除率为96.52%，水提取物仍为最弱。

2.2.3 不同溶剂提取物的铁离子螯合能力

由图5可知，4种不同溶剂提取物均是良好的铁离子螯合剂。铁离子螯合能力与提取物浓度呈正相关。其中，正丁醇提取物增强最为显著，当浓度达到20.0 mg/mL时，铁离子螯合能力达到73.29%，显著高于阳性对照柠檬酸(65.85%)，其中甲醇提取物铁离子螯合能力最弱，在浓度为20.0 mg/mL时，仅有63.43%。

2.2.4 贯叶连翘不定根不同溶剂提取物抗氧化能力比较

由表4的EC50值可以看出，不定根的不同溶剂提取物皆有一定的抗氧化活性，乙醇和甲醇提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基均表现出较强的清除能力，而正丁醇提取物则具有较好的铁离子螯合能力，而水提取物在3组试验中均表现出较弱的抗氧化能力。

表4 不同溶剂提取物抗氧化能力比较

2.3 抗氧化综合能力评价

利用层次分析法计算DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和铁离子螯合能力的成对比较矩阵各指标权重和综合能力，结果见表5，标准层权重系数为Wi=[0.443 0.387 0.169]，一致性指标CI = 0.009，随机一致性比率CR=0.016<0.1，表明各因素的权重符合条件，所有矩阵一致性合理。

表5 层次分析结构模型中成对比较矩阵及各抗氧化能力权重

由于贯叶连翘不定根水溶剂提取物的抗氧化能力较低，所以根据表5的权重只计算贯叶连翘不定根的正丁醇提取物、甲醇提取物、乙醇提取物的抗氧化能力综合评分(最低评分的提取物抗氧化综合能力最强)(图6)。正丁醇提取物的抗氧化综合评分为1.469，甲醇提取物综合评分为1.360，乙醇提取物综合评分为0.975，因此，乙醇提取物的抗氧化综合能力最强。

3 讨论与结论

天然绿色抗氧化剂可络合促氧化的金属离子，有效抑制自由基的产生，促进抗氧化酶和抗氧化因子的产生，如Gao等[29]研究发现，绿茶不仅有较强的自由基清除能力，而且也有很好的络合铁离子的能力；吴亚楠等[30]发现，玉米须的DPPH自由基清除能力很强，起到很好的抗氧化作用，可进一步应用在医药及化妆品等行业中。就贯叶连翘而言，葛莉等[31]研究了不同收获期贯叶连翘花中抗氧化能力，发现在处于花蕾期至盛花期时花器官抗氧化能力较强。贯叶连翘不定根培养已有一些研究报道，但对培养的不定根是否具有抗氧化能力至今尚未报道。该研究发现，生物反应器培养的贯叶连翘不定根4种不同溶剂提取物的抗氧化能力均随着提取物浓度的升高而增强，最高的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和铁离子螯合能力分别出现在甲醇、乙醇和正丁醇提取物中。可见，用不同评价方法测定的最高抗氧化能力会因提取溶剂而不同[32]。面对这种不同抗氧化评价指标所出现的不同结果，如何进行综合评估就成为提取工艺及进一步的产品生产所面临的问题。而将层次分析的多指标评价系统应用在不同评价指标或无结构特性的复杂问题中是一种清晰明了的方法，并且在每个层次中的每个因素对结果的影响程度都是量化的，既考虑了研究人员对每项指标的关注程度，又考虑了每项指标本始数据之间的相关性，这使整体评价效果更加正当和科学[33]。该试验利用层次分析法对贯叶连翘不定根抗氧化综合能力进行评价，得到正丁醇、甲醇、乙醇提取物的综合评分，分别为1.469、1.360和0.975，表明乙醇提取物的抗氧化综合能力最强，因此，贯叶连翘不定根用于抗氧化相关产品生产时，建议以乙醇作为溶剂进行提取。通过该研究可知，层次分析法是可用于对抗氧化能力的多种指标权重进行综合评价的一种理想途径，对于促进抗氧化相关产品的研发与应用发展具有实质性的重要意义。