UPLC 法测定黄黑小斑蝥中的斑蝥素

雷欣宇，陈 松，刘昌华，仲伶俐，李 曦

（四川省农业科学院，a.农业质量标准与检测技术研究所；b.植物保护研究所，成都 610066）

斑蝥又名芫菁、斑猫、地胆，为鞘翅目芫菁科昆虫，虫体具有特殊臭气，在全国大部分地区均有分布。据药典记载，斑蝥性味辛、热，有大毒，归肝、胃、肾经，具有破血逐瘀、散结消瘸、攻毒蚀疮的功效［1］。斑蝥有效成分为斑蝥素，现代医学对斑蝥素药用功能研究发现，斑蝥素及其衍生物对肿瘤细胞活性具有明显抑制作用［2］，在临床上对肝癌、胃癌、卵巢癌等均具有一定疗效。收录于《中华人民共和国药典》的药用斑蝥有南方大斑蝥（Mylabris phalerataPallas）和黄黑小斑蝥（Mylabris cichoriiLinnaeus）2 种，其斑蝥素含量要求不得少于0.35%。近年有关斑蝥素含量的研究主要集中在不同种类、不同发育阶段、不同部位以及不同饲养方式［3-6］，针对同种斑蝥在野生与饲养条件下的斑蝥素研究却鲜有报道。目前斑蝥素的测定大部分采用气相色谱和普通液相色谱法，UPLC 具有比普通液相色谱分离度好、灵敏度高、分析速度快等优点，其用于斑蝥素测定尚未见报道。本研究建立UPLC 法测定斑蝥素，可为斑蝥的质量控制提供一个科学高效的评价方法，通过对野生与人工饲养黄黑小斑蝥中斑蝥素含量进行比较，以期为饲养斑蝥的药用开发可能性提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1290Ⅱ超高效液相色谱仪（配紫外检测器），美国Agilent 公司；IKA-RV10 涡旋蒸发仪，德国IKA公司；AUY220型分析天平，日本岛津公司；QIlinbeier涡旋混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ5200DE超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂与供试样品

乙腈（色谱纯），美国Fisher 公司；丙酮（分析纯），西陇化工；浓盐酸（分析纯），西陇化工；斑蝥素对照品（CAS 号：56-25-7，纯度＞98%），北京索莱宝科技有限公司。黄黑小斑蝥，野生样品与饲养样品均由四川省农业科学院植物保护研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱ACQUITY UPLCBEH C18（2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）；流动相乙腈+水（40+60）；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL；紫外检测波长230 nm。此条件下色谱见图1，色谱峰理论板数按斑蝥素计大于3 600，斑蝥素保留时间为3.61 min，比普通液相法提早近60%［7］。斑蝥样品色谱图中目标峰与干扰峰之间分离度大于1.5，满足分离要求。

图1 斑蝥素对照品（A）与供试品（B）UPLC 色谱

1.3.2 溶液制备

1）对照品溶液制备。精密称取斑蝥素对照品10 mg，乙腈溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配成浓度为1 mg/mL的斑蝥素对照品储备液。

2）供试品溶液制备。精密称取经60 ℃烘干、粉碎后的斑蝥样品粉末0.5 g 于锥形瓶中，加入1.0%盐酸/丙酮30 mL，超声处理30 min。提取液过滤，用少量丙酮分次洗涤锥形瓶，洗液并入滤液中。滤液经旋转蒸发仪浓缩至近干，准确加入2 mL 乙腈，过0.22 μm 滤膜，即得。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系与灵敏度 精密吸取对照品溶液，准确配制成浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL 系列对照品标准溶液，由低到高依次进样检测。以峰面积为纵坐标（y），对应标准溶液浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到回归方程为y=464.156x-0.878 6，相关系数为0.999 9，表明斑蝥素在0.02～1.00 mg/mL 线性关系良好。将斑蝥素对照品溶液逐级稀释进样检测，以信噪比（S/N）＞3 时的质量浓度为检出限，信噪比（S/N）＞10 时的质量浓度为定量限，再根据方法的稀释倍数换算，计算得方法检出限为40 mg/kg，定量限为80 mg/kg。

2.1.2 精密度试验 取低、中、高3 个浓度的斑蝥素对照品溶液，按照色谱条件连续进样6 次，其保留时间与峰面积RSD见表1，表明仪器精密度良好。

表1 斑蝥素精密度试验结果

2.1.3 稳定性试验 取同一批对照品溶液放置于4 ℃冰箱和仪器自动进样室内，分别于0、2、8、16、24 h 进样测定，其峰面积RSD见表2，表明斑蝥素在4 ℃冰箱和仪器自动进样室内放置24 h 均可保持稳定。

表2 斑蝥素稳定性试验结果

2.1.4 回收率与重复性 将经过多次提取后的斑蝥样品回收作为阴性样，分别添加不同浓度的斑蝥素对照品溶液，每个水平做5 份，制备供试品溶液，按色谱条件测定。由表3 可知，不同添加水平的斑蝥素回收率为97.9%～100.9%，RSD为1.7%～3.8%，说明该方法准确、可靠，可应用于斑蝥中斑蝥素的测定。

表3 斑蝥素加标回收试验结果

2.2 酸提试验

分别以丙酮和1%盐酸/丙酮作为提取液，测定经超声提取后野生和人工饲养斑蝥中斑蝥素含量。结果表明（表4），酸提液能显著提高斑蝥素得率，其中人工饲养斑蝥素得率提高了近1 倍，野生得率提高了近2 倍。

表4 提取液对斑蝥素得率的影响（单位：%）

2.3 样品含量测定

2 种方法测得野生和人工饲养斑蝥中斑蝥素的含量结果见表5。

表5 野生与人工饲养斑蝥中斑蝥素测定结果（单位：%）

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

分别比较了甲醇/水、甲醇/甲酸水、乙腈/水和乙腈/甲酸水4 种流动相的分离效果，其中含有甲酸的流动相出峰杂乱，无法分离目标物；与甲醇/水体系相比，乙腈/水流动相分离度更好，干扰峰少且峰形尖锐对称。随着乙腈比例增加，目标物保留时间明显提前，但考虑样品基质复杂，出峰过早容易受杂质峰干扰，为保证分离效果，选择乙腈/水以40∶60 比例进行等梯度洗脱。

3.2 提取方式的选择

斑蝥素提取常用有索氏提取、冷浸提取、超声提取等方法［8，9］。试验采用操作简便的超声提取法，分别考察了溶剂提取量（15、30、60、90、120 mL）、提取时间（10、20、30、40、60 min）和提取溶剂（丙酮、乙醇、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、甲醇）对斑蝥素提取效果的影响，结果表明采用30 mL 丙酮超声提取30 min的效果最好。

3.3 酸提试验效果

斑蝥素是一种酸酐，能与钠、钙、镁、钾等金属元素结合，形成斑蝥素钠盐、钙盐或镁盐等结合性斑蝥素。斑蝥体内的斑蝥素通常以游离态和结合态形式同时存在，结合态斑蝥素在酸性条件下能够水解出游离斑蝥素，因此经水解后检测的斑蝥素更能反映出总体水平。在参考相关文献基础上［10，11］，试验考察了盐酸、甲酸、醋酸对斑蝥素提取效果的影响，结果以1%盐酸提取效果最佳。酸提试验结果表明，野生斑蝥和人工饲养斑蝥经1%盐酸/丙酮提取后测得斑蝥素含量相比丙酮提取法有1～2 倍的提升，提取效果显著。表明野生斑蝥与饲养斑蝥均存在结合态斑蝥素，经酸水解成游离态后被一同检测出来，因此测得值为斑蝥素总量值。同时，从加酸与不加酸处理的结果差值大小来看，野生斑蝥中斑蝥素以结合形态为主，人工饲养斑蝥中斑蝥素游离态和结合态占比基本持平。

3.4 样品含量分析

本研究方法测得野生和人工饲养斑蝥中斑蝥素含量分别为3.080%和1.630%，约为药典法测得值的3～4 倍。药典法采用二氯甲烷提取，测定结果仅反映斑蝥体内游离斑蝥素含量，本研究方法检测出的斑蝥素总量更能准确反映出斑蝥素真实水平，这对于斑蝥的用药安全具有一定的参考价值。野生斑蝥游离和总量斑蝥素均高于人工饲养斑蝥，显现出了品种优势，但人工饲养斑蝥的斑蝥素含量符合药典对斑蝥药材来源中斑蝥素含量的规定，表明人工饲养斑蝥亦可作为提取斑蝥素的来源药材，这对于缓解因野生斑蝥资源紧缺造成的市场供求矛盾有积极作用。目前斑蝥人工饲养的研究已有相关报道［12，13］，可知饲养的光温土壤环境、喂养食物种类等均会对斑蝥素的累积产生影响。如何优化斑蝥养殖技术，获取高质量斑蝥素尚待继续研究。