LncRNA-HULC通过稳定SIRT1蛋白调控肝癌Hep G2细胞自噬和化疗耐药的机制

肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的人类恶性肿瘤细胞之一，是导致癌症相关死亡的第二大原因。尽管最近对肝癌的分子基础和新的化疗方法的认识有了进展，但是仅略微降低了死亡率

。长链非编码RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一类长度超过200 nt，没有或有蛋白质编码潜力的转录本。LncRNA通过在不同水平上调控基因表达来发挥作用，包括表观遗传调控、转录（或转录后）和翻译调控

。已经证实LncRNA参与了机体的发育、分化、凋亡、自噬、炎症和癌症等生理或病理过程

。最近，越来越多的lncRNA被报道在肝癌的癌变和发展中发挥重要作用

。HULC是第一个在人类肝癌组织中特异性过表达的LncRNA

。然而，迄今为止，HULC是否能够调节HCC细胞的自噬尚不清楚。同时，HULC对化疗试剂的反应亦不清楚。本文通过比较对照组 （NOR 组），基因过表达组（O-HULC组），基因抑制组（S-HULC组）肝癌Hep G2细胞的自噬，凋亡，侵袭迁移情况，评价HULC对肝癌Hep G2细胞的细胞自噬和化疗耐药的影响机制。以图寻找关键作用通路及作用靶点，为日后肝癌的治疗提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及分组 选取美国ATCC细胞库来源的Hep G2细胞。细胞分为3组，NOR组、O-HULC组和S-HULC组。NOR组不做处理，正常培养，O-HULC组转染HULC基因，S-HULC组抑制HULC基因后培养。

1.2 实验方法

1.2.1 HULC基因过表达肝癌细胞Hep G2 在感受态的细胞中加入质粒和连接产物，在冰上静置后于45 ℃下迅速水浴，之后再次置于冰上，在含有抗生素的培养板上培养过夜后按照说明书提取质粒并用琼脂糖凝胶电泳检测DNA表达，包括纯度和表达量。质粒转染，将生长状态较好的细胞接种于细胞培养板中，每孔加入含有质粒的无血清培养基，后加入转染试剂，然后加入到培养箱中培养，每隔10 min摇晃一次，6～8 h后更换培养基。目的基因扩增，提取出RNA后进行PCR扩增，得到cDNA后加入引物，以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增后用限制性内切酶酶切，而后siRNA转染。

1.2.2 肝癌Hep G2细胞侵袭和迁移量检测 ①细胞侵袭能力检测：将细胞加入到Transwell的上室中，加入4 μmol/L的奥沙利铂溶液（美国Sigma公司）之后用伊红染料将穿过基质胶包裹的下室的肝癌细胞进行染色。然后显微镜下进行细胞计数。②细胞迁移能力检测：将加入奥沙利铂溶液的细胞加入到Transwell的上室中，然后显微镜下对下室的肝癌细胞进行细胞计数。实验每组平行6次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，计数资料用率表示，组间比较用χ

分析；检验水准为α＝0.05，

＜0.05表示差异有统计学意义。

1.2.3 RT-PCR 法测定基因表达量 使用QiagenOneStep RT-PCR试剂盒（美国Qiagen公司，批号：210210）完成qRT-PCR实验。根据说明书要求，采用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒和TaqManmiRNA分析完成总RNA的聚腺苷酸化和逆转录过程。β-actin的表达用作内部对照。被测基因的相对表达利用2

方法计算标准化。每个样品进行3 次重复测试。每种试剂的量如下：5 μL 2X qPCR Mix，1 μL引物工作溶液（2.5 μM），引物序列见表1，1 μL模板，2.8 μL ddH2O和0.2 μL Rox染料。

2.5 各组肝癌细胞COX-2 和LC3 Ⅱ蛋白表达量 与S-HULC 组相比，NOR 组和O-HULC 组 的COX-2及LC3Ⅱ的蛋白表达量升高，其中O-HULC组高于NOR组（

＜0.05），见表6和图2。

2.2.1 城市建设占用部分耕地面积，导致耕地面积有所减少35.3%，城镇用地、农村居民点及其他建筑用地的面积有所增加。

2 结果

癌症细胞的典型特点是增殖迅速，侵袭迁移能力强大，所以侵袭迁移能力是评判癌症细胞活力的一项重要表观指标。有报道显示，癌症模型小鼠的癌症程度越严重，其癌症细胞的迁移侵袭能力越强

。研究表明，lncRNA-HULC可以减弱HCC化疗药物如索拉非尼、顺铂、5-氟尿嘧啶（5-fu）等，可降低化疗敏感性和细胞凋亡，导致癌细胞存活

。本实验在应用化疗药物作用细胞后，癌细胞发生凋亡，侵袭和迁移，但是HULC一旦被抑制，侵袭迁移能力降低，凋亡率高于O-HULC组，提示HULC影响癌细胞对化疗药物的敏感性。

发《寻人启事》寻找女儿，对于由于时间的流逝情绪已稍稍平缓的张秋来说，是有些残酷和痛苦的，然而，张秋的这种痛苦也同时会激起犯罪分子的快感，犯罪分子很可能会跳出来再往张秋痛苦的心里撒把盐。

2.4 各组肝癌细胞USP22 和SIRT1 蛋白表达量 与S-HULC组相比，NOR组和O-HULC组的USP22及SIRT1蛋白表达量升高，其中O-HULC组高于NOR组（

＜0.05），见表5和图1。

本文所述土箱产茧应选择远离道路的场所，产卵茧期应保持安静，避免土壤震动，否则正在产卵茧的水蛭会受惊而逃走，造成空茧。首先挖一个深度25cm的矩形浅坑，将网箱铺盖在坑上，用越冬分化土（松软）填满。接着向网箱中加水，使土湿度保持在30%左右。投放密度为200-300只每平米，投放完成后用透气纱布将网箱扎起防止水蛭逃离，并盖上水草或树枝等进行遮光。在坑四周挖一条排水沟，防止暴雨天气雨水将网箱浸透，在下雨天气要及时疏通溢水口。投放后第二日打开网箱检查水蛭是否都已入土产茧，洞口内有白色泡沫即为水蛭产茧。整个产茧过程持续约12-14天，土壤温度为20℃左右，每条水蛭平均能产茧3-4个左右。

2.3 各组肝癌Hep G2细胞的细胞迁移和侵袭能力 与S-HULC组相比，NOR组和O-HULC组肝癌Hep G2细胞迁移数量和侵袭数量显著增加，其中O-HULC组显著高于NOR组（

＜0.05），见表4。

1.2.4 Western Blot法测定蛋白含量 ①提取蛋白：利用超声组织破碎仪破碎细胞[破碎条件为4 次/（管·300 W）]，细胞破碎后4 ℃或冰上放置30 min，将破碎后的细胞进行4 ℃离心，12 000 g离心30 min，收集上清液，即为蛋白抽提液。②蛋白定量：使用BCA法测定蛋白浓度。③凝胶电泳：取待测标本15 μL进行上样，使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，至目的分子量出现。④湿法转膜：采用湿法将蛋白条带电转至Immun-blot PVDF膜上，加入浓度为50 g/L的脱脂奶粉在20 ℃的条件下封闭震荡处理3 h，加入以下抗体[小鼠抗人USP22单克隆抗体（1∶400）、兔抗人和SIRT1（1∶400）多克隆抗体]，4 ℃孵育过夜。使用经过辣根酶标记的IgG（1∶1 000），在温度为37 ℃的条件下孵育2 h。⑤发光显影和图像分析。

2.2 各组肝癌Hep G2细胞凋亡率 各组添加化疗药物后整体呈现凋亡趋势，随着培养时间的延长，细胞的凋亡率逐渐升高，与S-HULC组相比，NOR组和O-HULC组肝癌Hep G2细胞凋亡率降低，其中O-HULC组低于NOR组（

＜0.05），见表3。

3 讨论

LncRNA作为一种新型的RNA，由于参与多种细胞过程和在癌症生物学中发挥重要作用而受到广泛关注。在HCC中首次发现的lncRNA-HULC已被证实参与包括肿瘤异常生长在内的多个病理过程

。然而，目前相应的机制还不是很清楚。

2.1 各组肝癌Hep G2细胞自噬情况 各组的肝癌Hep G2细胞自噬情况随药物添加时间延长而增加，与S-HULC组相比，O-HULC组和NOR组肝癌Hep G2细胞自噬情况显著增加，其中O-HULC组高于NOR组（

＜0.05），见表2。

越来越多的证据表明，自噬的保护作用是导致癌细胞耐药的重要原因

。自噬是一种保守的分解代谢过程，当细胞在应激条件下或营养缺乏时，负责清除和降解过量或不必要的蛋白质，从而应对饥饿或细胞压力（如化疗药物）

。因此，更好地了解参与保护性自噬的分子进程，并在化疗过程中干预这些关键靶点，有助于研究实现肝癌患者干预治疗。已证实长链非编码RNA与细胞自噬相关

。如研究发现MTOR激动剂（3BDO）可通过下调LncRNA-FLJ11812促进MIR4459对ATG13的抑制作用，抑制细胞自噬

。LncRNA APF可通过抑制miR-188-3p的水平和活性从而上调ATG7的水平进而诱导细胞自噬

。本实验也发现相似的结果，发现HULC的过表达可以有效上调肝癌细胞的自噬百分比。但是机制尚不明确，为此，我们将选择蛋白实验进一步进行机制验证。

余热利用方式可分为热交换式和吸收式。其中热交换式是通过利用余热的焓，将其能量交换出来，转化为蒸汽或热水，主要设备有余热锅炉、板式换热器等；吸收式是通过利用余热的，综合考虑其热量及品质，将低品位的能量转化到另一介质中存在，主要设备有吸收式制冷、吸收式热泵等。

三是做大水利投融资平台。省政府成立了省水利发展投资有限公司，注册资本金50亿元，主要由省财政注资，采取多元投资方式，省水利厅管理为主，通过市场融资，解决湖南省水利建设投入不足的问题。各市县水利投融资平台通过财政注入资金、金融机构贷款、土地储备等方式，融资90亿元。

USP22是去泛素酶（DUBs）成员

，SIRT1 通 过调控许多自噬关键成分，如自噬相关蛋白（Atg）5、Atg7、Atg8、海马区自噬相关蛋白1（Beclin1）、叉头转录因子O 亚家族1（FoxO1）等诱导自噬

。COX-2可催化花生四烯酸生成前列腺素，介导多种生理和病理过程

。研究表明，COX-2在结直肠、前列腺、乳腺、胃、肺和肝脏等多种人类器官中均有上调

。SIRT1与COX-2是USP22的直接底物，可通过USP22介导去泛素化

。本研究发现与S-HULC组相比，NOR组和O-HULC组的USP22、SIRT1、COX-2 及LC3 Ⅱ蛋白表达量升高，其中O-HULC组高于NOR组，说明在HCC细胞中，随着HULC 被抑制，USP22、SIRT1、COX-2 及LC3 Ⅱ蛋白表达量降低。说明HULC可降低肝癌Hep G2细胞对化疗试剂的敏感性，从而触发了肝癌Hep G2 细胞的保护性自噬，可能与信号通路“HULC-USP22-SIRT1/COX-2-LCⅡ”有关，其降低了肝癌细胞对化疗药物的敏感性。

综上所述，LncRNA-HULC可以稳定SIRT1调控细胞自噬降低细胞对化疗药物的敏感性，可能与信号通路“HULC-USP22-SIRT1/COX-2-LCⅡ”有关，此通路可能是开发肝癌化疗新增敏策略的新靶点。

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