松木石油醚和甲醇提取物分析及其对木腐菌抑制效果∗

周 昊 陈虹霞 陶 冉 叶建中 王成章

（1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所，生物质化学利用国家工程实验室，国家林业和草原局林产化学工程重点实验室，江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042；2.南京林业大学江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037）

松树是我国的主要树种之一，广泛分布于东北及华北地区，是重要的木材和松脂生产原料[1-2]。我国松树有20 余种，资源面积超过1 400 万hm2[3]。次生代谢产物是林木的重要组成部分，对林木颜色、抗性、防腐性、强度、渗透性等性质具有很大影响[4-9]。松木中含有丰富的次生代谢产物。研究表明：其中的酚类和萜类成分对松木材防腐、抗虫等性能具有重要影响。任琴等[10]研究发现，马尾松中萜类化合物的组成、含量和组成差异与抗性之间有明显的相关性，对松木抗病虫害具有重要作用。李坚等[11]研究发现，落叶松甲醇提取物对一些腐朽菌具有很好的抑制能力。目前，针对不同品种松木的次生代谢产物，有关其化学组成与木材防腐性相关的研究鲜有报道。因此，本研究以6 种不同品种的松木材为原料，通过溶剂浸提得到不同品种松木的石油醚和甲醇提取物，采用液质联用法（LCMS）和气质联用法（GC-MS），分别对甲醇提取物和石油醚提取物的化学成分进行分析。同时，对不同品种松木的石油醚和甲醇提取物的主要成分和含量进行比较，并采用牛津杯法检测不同品种松木的石油醚和甲醇提取物对木腐菌（密粘褶菌）的抑制效果。通过评价松木中关键次生代谢产物对木材防腐性能的影响，为松木木材保护提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolicaLitv.）、落叶松[Larix gmelinii(Rupr.) Kuzen.]、花旗松[Pseudotsuga menziesii(Mirb.) Franco]、辐射松（Pinus radiataD.Don）、马尾松（Pinus massonianaLamb.）、油松（Pinus tabuliformisCarr.）6 种松木芯材由江苏省长山林场提供；密粘褶菌[Gloeophyllum trabeum(Pers.: Fr.) Murr.]由中国林科院菌种保存中心提供；马铃薯琼脂培养基（PDA）购于南京库仑生物科技有限公司；甲醇、石油醚等化学试剂均为分析纯，购于南京化学试剂有限公司。

1.2 设备

往复式水浴恒温摇床（SHA-82A 型，常州金坛精达仪器制造有限公司）；电子天平（BSA224S 型，德国赛多利斯公司）；旋转蒸发仪（RE-2000A 型，上海亚荣生化仪器厂）；质谱仪（XEVO-G2XS-QTOF-MS，美国waters公司）；气相色谱质谱联用仪（7890A/5975C，美国安捷伦公司）。

1.3 提取物制备

将6 种松木样品切成小段，粉碎备用。分别取松木粉末100 g，加入到1 000 mL的圆底烧瓶中，加入500 mL的石油醚，90 ℃条件下回流提取2 h，提取2 次后，合并2 次的提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩，回收石油醚，所得沉淀物即为松木石油醚提取物。

松木经石油醚提取后得到脱脂松木粉，分别取脱脂松木粉200 g，加到1 000 mL的圆底烧瓶中，加入500 mL的甲醇溶液，75 ℃条件下回流提取2 次，每次2 h，合并2 次甲醇提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩，回收甲醇，所得沉淀物即为松木甲醇提取物。

1.4 松木石油醚提取物GC-MS分析[12-17]

称取松木石油醚提取物0.1 g，用色谱正己烷溶液置于10 mL容量瓶中定容，随后用0.45 μm有机微孔滤膜过滤，将滤液置于进样瓶内进行GC-MS分析。

GC测试条件：色谱柱为HP-5石英毛细管柱 (30 m ×0.25 mm × 0.25 μm)；柱温80 ℃下，保持5 min；然后升温(5 ℃/min)至250 ℃；再保持20 min；进料量为1 μL；载气为He；载气流量1 mL/min；分流比50∶1。

质谱测试条件：EI离子源温度230 ℃；注入口温度为250 ℃；电子能量70 eV。采用Wiley 275 标准谱库检索定性。

1.5 松木甲醇提取物LC-MS分析[18-20]

称取松木甲醇提取物0.1 g，用色谱甲醇溶液置于10 mL容量瓶中定容，随后用0.45 μm有机微孔滤膜过滤，将滤液置于进样瓶内进行LC-MS分析。

LC测试条件：色谱柱：Cosmosil 5C18- MS-Ⅱ（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，80% B；5～35 min，80%B→44% B；35～45 min，44% B→40% B；45～65 min，40%B；65～75 min，40% B→80% B；75～80 min，80 %B）；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。

MS测试条件：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，采用多反应监测扫描模式；喷雾电压4.5 k V；毛细管温度350 ℃；吹扫气压力137.9 kPa；辅助气流速为10 mL/min；扫描范围为100～1 000 m/z；二级质谱碰撞能量（CID）：20 eV。采用UNIFI数据库进行化合物鉴定。

1.6 抑菌性能试验[21-22]

1.6.1 菌种活化与扩大培养

将密粘褶菌的菌种斜面接种在PDA斜面培养基上，置于30 ℃的恒温培养箱中培养72 h。将活化后的菌种继续接种到PDA液体培养基中，在28 ℃ 条件下220 r/min摇床振荡培养36 h，使菌株在液体培养基中扩大培养。

1.6.2 抑菌效果检测

分别称取松木甲醇提取物或石油醚提取物0.1 g，用水溶解加入10 mL容量瓶中定容待用。将已灭菌的马铃薯琼脂培养基(PDA)10 mL 熔化倒入培养皿中，待冷却凝固后，吸取0.4 mL菌液均匀涂布于培养基上，分别在每个培养皿中央呈对称放置2 个灭菌后的牛津杯（内径6 mm，外径7.8 mm，高10 mm），依次滴入0.3 mL松木甲醇提取物或石油醚提取物溶液，将培养皿放入培养箱，30 ℃ 恒温恒湿箱培养72 h，测量抑菌圈直径并记录。

2 结果与分析

2.1 不同品种松木石油醚提取物GC-MS分析

采用GC-MS对6个松木品种的石油醚提取物进行测定，确定各组成成分，采用峰面积归一化法计算各成分相对百分含量，结果见表1。由表1可知，从6种松木石油醚提取物中共鉴定出45种化合物，主要为萜类、酯类和脂肪酸等。其中樟子松鉴定出16种，落叶松鉴定出9种，花旗松鉴定出20种，辐射松鉴定出17种，马尾松鉴定出9种，油松鉴定出11种；总相对百分含量分别为96.82%，97.81%，98.63%，92.26%，99.96%和97.23%。可以看出，6种松木石油醚提取物主要含有长叶烯、石竹烯、氧化石竹烯、6-十八烯酸、脱氢枞酸和松香酸等化合物。此外，落叶松还含有较多量的13-表泪杉醇（21.63%）；花旗松含有较多量的2,6-二羟基-苯甲酸（6.73%）、5-氟-2-甲基苯甲酸（9.38%）和4α-[(R)-1,5-二甲基-3-氧代己基]-1-环己烯-1-羧酸（24.50%）；辐射松含有较多量的1,4-二甲基-2-硝基-咪唑（13.19%）和6，6-二甲基-10-亚甲基-1-氧杂-螺[4.5]癸烷（15.15%）；马尾松含有较多量的1-羟基-6-(3-异丙烯基-环丙基-1-烯基)-6-甲基-庚-2-酮（6.90%）和2-氯-3-硝基-9,10-蒽二酮（5.25%）；油松含有较多量的γ-榄香烯（5.85%）和2-氯-3-硝基-9,10-蒽二酮（7.89%）。

表1 不同品种松木石油醚提取物的化学成分分析Tab.1 Chemical composition analysis of petroleum ether fractions of di☆erent pine varieties

（续表1）

2.2 不同品种松木甲醇提取物LC-MS分析

采用LC-MS对6 个松木品种的甲醇提取物进行测定，确定各组成成分，并记录各化合物的响应值，结果见表2。由表2 可知，从6 种松木甲醇提取部位中共鉴定出59 种主要化合物，主要为酚类、有机酸类和黄酮类等。其中，樟子松鉴定出32 种，落叶松鉴定出44 种，花旗松鉴定出53 种，辐射松鉴定出48 种，马尾松鉴定出37 种，油松鉴定出48 种。可以看出，这6 种松木的甲醇提取物共有成分主要是正丁苯酞、莪术烯、氧叶B、蓬莪术环二烯、二氢-N-甲基异石榴皮碱、催吐萝芙木醇、金钗石斛素、14-去氧穿心莲内酯、(10E)1,10-十七烷-二烯-4,6-二炔-3,8,9-三醇、邻苯二甲酸丁醇异丁醇二酯、二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸酐、1-羟基蒽醌、伞形花内酯和桑酮。此外，樟子松还含有较多量的6,7-去氢青蒿酸、落叶松脂素、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸、(+)-1-羟基松脂素、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、臭灵丹酸等；落叶松含有较多量的远志讪酮Ⅱ、3-硫酸基槲皮素、异落叶松脂素、6,7-去氢青蒿酸、反对香豆酸、弗斯生、泽泻萜醇 C、臭灵丹酸、白及联菲醇 D、2,4,6-三羟基苯乙酮-2,4-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、甘氨胆酸、钩状石斛素等；花旗松含有较多量的远志讪酮Ⅱ、3-硫酸基槲皮素、(+)-1-羟基松脂酚、异落叶松脂素、裂环异落叶松脂素、芳姜黄酮、弗斯生、臭灵丹酸、乙酸-β-松油酯、白及联菲醇 D、2,4,6-三羟基苯乙酮-2,4-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、甘氨胆酸、钩状石斛素、赤式-二羟基脱氢二松柏醇、3-O-乙酰基-咖啡酸等；辐射松含有较多量的对羟基苯甲苹果酸、6,7-去氢青蒿酸、落叶松脂素、1,4-二羟基-2-甲氧基苯、弗斯生、松属素、土荆皮酸 C2、13-羟基-9,11-十六烷二烯酸、白及联菲醇 D、赤式-二羟基脱氢二松柏醇等；马尾松含有较多量的6,7-去氢青蒿酸、(+)-1-羟基松脂素、弗斯生、松属素、土荆皮酸 C2、白及联菲醇 D、赤式-二羟基脱氢二松柏醇、13-羟基-9,11-十六烷二烯酸等；油松含有较多量的异落叶松脂素、芳姜黄酮、臭灵丹酸、3,3',5,5'-四甲氧基-反-茋、脱氢枞酸、松属素、土荆皮酸 C2、白及联菲醇 D、赤式-二羟基脱氢二松柏醇、13-羟基-9,11-十六烷二烯酸等。

（续表2）

2.3 不同品种松木石油醚和甲醇提取物的抑菌性

采用牛津杯法分别检测了6 种松木的石油醚和甲醇提取物对密粘褶菌的抑制效果，结果见图1～3。由图可见，6 种松木的石油醚和甲醇提取物对密粘褶菌的生长均具有一定抑制作用。6 种松木石油醚提取物对密粘褶菌的抑菌能力大小为：马尾松＞油松＞樟子松＞辐射松＞花旗松＞落叶松；6 种松木甲醇提取物对密粘褶菌的抑菌能力大小为：花旗松＞辐射松＞油松＞马尾松＞落叶松＞樟子松。此外，可以看出松木石油醚提取物的抑菌效果优于甲醇提取物，可能是因为在石油醚提取物含有更多的萜类物质和有机酸[23-25]。

图1 6 种松木石油醚和甲醇提取物的抑菌圈大小Fig.1 Inhibition zone sizes of 6 pine petroleum ether and methanol extraction sites

图2 6 种松木石油醚提取物的抑菌效果图Fig.2 Bacteriostatic e☆ect of six pine petroleum ether extraction sites

图3 6 种松木甲醇提取物的抑菌效果图Fig.3 Bacteriostatic e☆ect of methanol extraction sites of 6 pine species

3 结论

1） 6种松木石油醚提取物主要包含萜类、酯类和脂肪酸等成分。其中，花旗松的提取物种类和含量较高；松木石油醚提取部位主要含有长叶烯、石竹烯、氧化石竹烯、6-十八烯酸、脱氢枞酸和松香酸等化合物。

2） 6种松木甲醇提取物主要包含酚类、有机酸类和黄酮类等成分。共有成分主要为正丁苯酞、莪术烯、催吐萝芙木醇、金钗石斛素、二氢猕猴桃内酯、1-羟基蒽醌、伞形花内酯和桑酮等。

3） 6种松木的石油醚和甲醇提取物均能抑制密粘褶菌的生长，石油醚提取物的抑菌能力大小为：马尾松＞油松＞樟子松＞辐射松＞花旗松＞落叶松；甲醇提取物的抑菌能力大小为：花旗松＞辐射松＞油松＞马尾松＞落叶松＞樟子松；松木石油醚提取物的抑菌效果优于甲醇提取物。