竹茹中苜蓿素含量的测定

林花王欣宇金龙哲王宇辉刁春研安然王怀志车成来

(1.吉林省延边朝鲜族自治州农业科学院，吉林 延吉 133001；2.吉林省汪清县农业技术推广中心,吉林 汪清 133100)

竹茹(Bambusae Caulisin Taenias)，为禾本科植物青秆竹、大头典竹或淡竹的茎秆的干燥中间层。竹茹具有清热化痰、除烦止呕等功效，常用于治疗热痰引起的痰热咳嗽、痰火挟痰、烦热呕吐等病症。竹茹是临床常用中药材之一[1]，自古以来竹的品种多样，导致竹茹的基元植物有很多种。宋·唐慎微《证类本草》中就记载有淡竹茹、苦竹茹、青竹茹之分[2]。日本学者村井杶在《药征续编》中提出“凡方内称竹茹者，用淡竹之茹。若无，则诸竹亦可权用”[3]。竹茹提取物中所含有的苜蓿素(Tricin)是天然黄酮的一种，具有抗炎[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、抗病毒[7]和免疫调节[8]的作用。相关实验表明[9]，苜蓿素有抗肠癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、白血病等恶性肿瘤作用。虽然苜蓿素的药理作用一直是学者的研究目标，但是对于苜蓿素在植物中的含量测定实验相对较少，缺少含量标准提供参考。竹茹、竹根和淡竹叶等禾本类中草药里苜蓿素的含量较高，且我国竹资源丰富、价格低廉，在未来的开发利用方面具有极大的优势。

高效液相色谱技术[10]在化学、医学、工业、农学等学科领域中得到广泛的应用。高效液相色谱有着高压、高效、高灵敏度的特点，且应用范围广、分析速度快、载液流速快。此外，还有色谱柱可以反复应用，样品易回收、不易被破坏的优点。本文运用高效液相色谱法为竹茹中苜蓿素的含量测定提供参考数据。

1 实验材料与仪器

1.1 药材与试剂

竹茹药材，延吉市药房；甲醇，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸乙酯，分析纯，北京化工厂；二氯甲烷，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；柱层层析硅胶，200～300目，青岛海洋化工厂；薄层层析硅胶，GF254，青岛海洋化工厂；乙醇，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；三氯甲烷，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸，分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司；蒸馏水、纯化水，自制。

1.2 实验仪器

旋转蒸发器N-1200B型，东京理化器械株式会社；制备型中压液相色谱仪CHEETAN MP100，博纳艾杰尔科技有限公司；超声波清洗仪SB-5200，宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平AR124CN，奥豪斯仪器有限公司；DAD高效液相色谱Chromaster 5430，日本岛津仪器有限公司；循环水式多用真空泵SHB-IIIA，上海豫康科教仪器设备有限公司；超纯水机Unique-R20，厦门锐思捷水纯化技术有限公司；恒温水浴锅N-1200B型，东京理化器械株式会社；高速万能粉碎机TKB3-6661-01，东京理化器械株式会社。

2 实验方法

2.1 竹茹中苜蓿素的提取分离

2.1.1 竹茹的提取

取竹茹4.5kg，用95%乙醇加热回流提取3h，共提取3次，过滤收集3次的滤液，将滤液旋干得竹茹提取物浸膏570g。将竹茹95%乙醇层中的浸膏加入蒸馏水1500mL并搅拌溶解，加入等体积石油醚进行萃取，同法萃取3次，合并萃取液并将萃取液旋干，得到竹茹石油醚层浸膏118g。加入相同体积的乙酸乙酯继续进行萃取，萃取3次，合并萃取液并将萃取液旋干，得到竹茹乙酸乙酯层浸膏43g。提取过程见图1。

图1 竹茹提取分离流程图

2.1.2 苜蓿素的分离

将乙酸乙酯萃取物以干法上样。选用石油醚∶乙酸乙酯(30∶1～1∶1)为溶剂系统进行梯度洗脱，每250mL为1个流份。通过TLC结果，合并相同组分，共得到12个组分，标记为A～L。

将I组分(1.5g)利用正向硅胶柱层析法，干法上样，以二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇(150∶10∶1～10∶10∶1)进行梯度洗脱，将得到的各组分根据薄层色谱点板结果，合并相同的组分，得到苜蓿素68mg。

图2 苜蓿素的分离流程图

2.2 竹茹中苜蓿素含量测定方法建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo C18 ODS(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为1%乙酸水溶液(A)-乙腈(B)；检测波长为354nm；柱温为40℃；进样量为10μL；流速为1.0mL·min-1。梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2.2 对照品溶液配制

称取苜蓿素标准品适量，加入甲醇超声溶解，制成0.2mg·mL-1溶液，用微孔滤膜过滤，备用。

2.2.3 供试品溶液制备

取竹茹药材1kg，用95%乙醇冷浸法浸泡3d，过滤旋干后将浸膏用蒸馏水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3次，分别合并萃取液，将得到的乙酸乙酯层萃取物旋干，加甲醇溶解，制成20mg·mL-1溶液，用微孔滤膜过滤，备用。

2.2.4 线性关系考察

精密称定苜蓿素10mg，用甲醇溶解并稀释成0.5mg·mL-1储备液，分别精密吸取上述储备液1mL、1.5mL、3mL、5mL、7mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。进样量10μL，记录峰面积。以浓度X(μg·mL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，测定结果如表2所示，得到回归方程：Y=36009X-44332，R2=0.9995，线性范围为0.05～0.35mg·mL-1，标准曲线见图5。

图5 苜蓿素标准曲线

表2 不同浓度标准溶液测定结果

2.2.5 精密度的考察

取2.2.3下供试品溶液，按2.2.1下色谱条件测定，进样量10μL，连续进样6次。根据峰面积计算相对标准偏差，考察精密度。经计算，峰面积均值为5223051，RSD为0.23%，表明仪器的精密度良好。结果见表3。

表3 精密度检验结果

2.2.6 重复性的考察

取同一批竹茹供试品，按2.2.3下的方法制备供试品溶液6份，并按2.2.1下色谱条件测定，进样后根据得到的峰面积值计算相对标准偏差，考察重复性。经计算,峰面积均值为4783915，RSD为1.12%，表明该方法重复性良好。结果见表4。

表4 重复性检验结果

2.2.7 稳定性考察

取竹茹供试品溶液，按2.2.1下色谱条件测定，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，根据峰面积计算RSD值，考察稳定性。经计算,峰面积均值为4818914，RSD为0.57%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好，结果见表5。

表5 稳定性考察结果

2.2.8 加样回收率

精密称取3份适量已知含量的竹茹供试品，分别精密加入各标准品，按2.2.1色谱条件测定，平均回收率为97.98%，RSD为0.60%，表明本方法加样回收率良好，准确可行。结果见表6。

表6 加样回收率实验结果

2.2.9 样品含量测定

取竹茹供试品，按2.2.3下方法制备浓度为20mg·mL-1的供试品溶液，连续进样6次，取平均值，根据峰面积计算含量。结果见表7。

表7 样品含量测定结果

将峰面积的平均值代进回归方程：Y=36009X-44332中，得X=134.53，即每20mg供试品中有0.1345mg的苜蓿素，最后测得竹茹乙酸乙酯层萃取物中苜蓿素的含量为6.73mg·g-1，百分含量为0.673%。竹茹中苜蓿素的含量为0.0064%。

3 实验结果

3.1 苜蓿素的结构鉴定

图6 苜蓿素的结构式

该化合物分子式为C17H13O7，分子量为330，黄色结晶，可溶于甲醇、吡啶、DMSO等溶剂。

在1H-NMR(500MHz,Pyridine-d5)中共出现了6个氢信号峰，包括羟基氢信号峰δH13.8(1H，s，5-OH)；芳香氢信号峰δH7.46(2H，s，H-2′,6′)、δH6.90(1H，d,J=2.0Hz，H-8)和δH6.77(1H，d,J=2.0Hz，H-6)；黄酮C环上的氢信号峰δH7.04(1H，s，H-3)；甲氧基位置上氢的信号峰δH3.88(6H，s，H-3′，5′-OCH3)。

在13C-NMR(125MHz,Pyridine-d5)中共出现了12个碳信号峰，推测为黄酮类化合物。包括酮基碳信号峰δC183.1(C-4)；苯环上的碳信号峰δC165.0(C-7)、δC163.5(C-9)、δC158.9(C-5)、δC149.7(C-3′，5′)、δC142.5(C-4′)、δC121.7(C-1′)、δC105.6(C-2′，6′)、δC105.4(C-10)、δC100.4(C-6)和δC95.4(C-8)；黄酮C环上的碳信号峰δC166.2(C-2)和δC104.8(C-3)；连接甲氧基的碳的信号峰δC56.9(C-3′，5′-OCH3)。

根据氢谱、碳谱以及程聪梅等研究方法[11]，确定该化合物为苜蓿素。

3.2 苜蓿素含量测定方法建立结果

3.2.1 精密度考察

测定6次峰面积，并计算平均值，其RSD值为0.23%，<2%，说明仪器的精密度良好。

3.2.2 重现性考察

测定6份样品，进样量为20mg·mL-1为1.12%，<2%，说明该方法的重现性良好。

3.2.3 稳定性考察

测定1份供试品溶液在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，进行含量测定。其RSD值为0.57，<2%，证明供试品溶液在24h内稳定，不易变质，可以进行长期的含量测定实验。

表8 苜蓿素氢谱及碳谱的化学位移

3.2.4 加样回收率考察

精密称取3份已知含量的供试品溶液，按照供试品成分含量的80%、100%、120%加入对照品，RSD值为0.60%，<2%，符合方法学验证中加样回收率的要求，证明本方法准确可行。

3.2.5 含量测定

通过上述实验，测得供试品竹茹乙醇提取物中苜蓿素的含量为6.73mg·g-1。

4 结论

在50.0～350.0μg·mL-1浓度范围内，苜蓿素的线性关系良好，为Y=36009x-44332(R2=0.9995)，精密度、稳定性、重复性试验的RSD均<2%(n=6)，加样回收率为97.98%(RSD=0.60%)，由此说明，HPLC法能够准确地测定竹茹中苜蓿素的含量。结果显示，苜蓿素在竹茹中的含量为6.73mg·g-1。过去的相关文献中，缺少竹茹中苜蓿素含量测定的报道，故本文为药典苜蓿素质量标准的制定提供了数据参考，为苜蓿素的后续研究提供理论依据。