人源性受磷蛋白稳定表达细胞系的构建

陈岚卿，王宇宁，李典一，徐路遥，李廉杰，李泽浩，刘华，刘茜

1.华中科技大学同济医学院法医学系，湖北 武汉 430030；2.法庭毒物分析公安部重点实验室 北京市公安局，北京 100000

受磷蛋白（phospholamban，PLN）是一种以单体或五聚体形式存在于肌浆网上的磷酸化蛋白，其丝氨酸16（serine 16，Ser16）和苏氨酸17（threonine 17，Thr17）位点可分别通过cAMP 依赖性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）被磷酸化。肌浆网和内质网Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic and endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）属于多基因家族，SERCA2a 在心肌细胞中含量最丰富，负责在心肌舒张期将大多数Ca2+从胞质中回摄至肌浆网，对调节胞质Ca2+浓度起主要作用[1-2]。PLN 通过与SERCA2a 的相互作用，在心肌Ca2+调节中发挥重要作用。

乌头碱是一类主要来自乌头属植物的药物，在传统中药以及民间饮食中应用广泛[3-4]。本研究采用新型四环素调控表达系统（商品名T-RExTM系统）和Flp/FRT 位点特异性重组技术，将人受磷蛋白基因稳定整合进人源性细胞的基因组FRT 位点（重组酶识别位点）处，利用多西环素（doxycycline，Dox）诱导，解除TRExTM细胞中四环素抑制子TetR 对启动子中TetO2的抑制，完成细胞中目的蛋白的表达[5-6]，并利用特异抗生素抗性筛选出稳定表达目的基因的细胞，从而构建人源性PLN 稳定表达Flp-InTMT-RExTM293 细胞系（human phospholamban stably expressing Flp-InTMT-RExTM293 cell line，hPLN-293），并初步探索其用于乌头碱心脏毒性分子机制研究的可行性。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒及主要试剂

Flp-InTMT-RExTM293细胞系、pcDNATM5/FRT/TO（以下简称pDFT）载体试剂盒、pOG44 Flp-重组酶表达载体（美国Invitrogen 公司），DH5α 感受态细胞（美国Thermo Scientific 公司），MGC Human PLN Sequence-Verified cDNA（英国Horizon 公司），聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）转染剂（美国Sigma-Aldrich 公司），Dulbecco 改良Eagle 培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清、灭瘟素、潮霉素B、Dox（美国Gibco 公司），抗PLN 单克隆抗体、抗Thr17-P-PLN 单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司），抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白单克隆抗体（美国Proteintech 公司），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠IgG、HRP 标记的羊抗兔IgG、异硫氰酸荧光素（flourescein isothiocyanate，FITC）标记的羊抗鼠IgG（中国Biosharp 公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色试剂、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、放射免疫沉淀法裂解缓冲液（radio-immunoprecipitation assay buffer，RIPA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、磷酸化蛋白酶抑制剂、脱脂奶粉、多聚甲醛固定液（中国Servicebio 公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；德国BioFroxx 公司）。

1.2 重组表达质粒的构建

采用FastCloning 方法[7]将目的基因PLN 的开放阅读框（open reading frame，ORF）序列插入pDFT 载体的多克隆位点形成重组质粒pDFT-PLN-Flag。根据载体序列设计合适引物，对重组质粒进行PCR 扩增，扩增产物电泳验证，并对含有目标DNA 大小片段的重组质粒进行测序。序列正确的质粒转化DH5α 感受态细胞复制培养、提取备用。

1.3 293 细胞转染及筛选

用DMEM 在直径10cm 细胞培养皿中培养Flp-InTMT-RExTM293 细胞系细胞，待细胞铺满皿底50%～70%时，以PEI 转染剂将构建的pDFT-PLN-Flag 与pOG44 Flp-重组酶表达载体共转染Flp-InTMT-RExTM293 细胞。转染细胞放入37 ℃的5%CO2孵箱中培养4～6 h 后换液，换液后再培养1 d 后用无抗生素的DMEM 按1∶2传代细胞，再培养1 d后换含有15 μg/mL灭瘟素和150 μg/mL 潮霉素的培养液培养，持续筛选培养出含灭瘟素和潮霉素双重抗性的稳定细胞株。从筛选的稳定细胞株中提取基因组DNA 进行测序。以美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中的人源性受磷蛋白基因ORF 序列为参考序列，验证插入序列的正确性。经验证后的稳定细胞株命名为hPLN-293细胞。

1.4 利用间接免疫荧光法检测hPLN-293 细胞中PLN 的表达

阴性对照组：向按1.3 节步骤初步筛选出的受磷蛋白过表达重组单克隆稳定细胞株（hPLN-293 细胞）中，加入Dox，使Dox 在总体系中的终质量浓度为200 ng/mL，用4%多聚甲醛固定后用PBS 缓冲液代替一抗进行孵育，再用FITC 标记的羊抗鼠IgG 二抗孵育，利用DAPI 染色试剂对其进行复染，进行抗体特异性检验。

未加Dox 诱导组：取hPLN-293 细胞，不加入Dox。用4%多聚甲醛固定后，用鼠来源的抗人PLN单克隆抗体孵育，再用FITC 标记的羊抗鼠IgG 二抗孵育，利用DAPI 染色试剂对其进行复染。

加入Dox 诱导组：取hPLN-293 细胞，加入Dox，使Dox 在总体系中的终质量浓度为200 ng/mL。用4%多聚甲醛固定，用鼠来源的抗人PLN 单克隆抗体孵育，再用FITC 标记的羊抗鼠IgG 二抗孵育，利用DAPI染色试剂对其进行复染。

三组细胞在蔡司LSM 800 with Airyscan 激光共聚焦显微镜（德国ZEISS 公司）下观察PLN 的表达。

1.5 利用Western 印迹法检测hPLN-293 细胞中PLN 的表达

将hPLN-293 细胞持续培养、传代，选1 代、5 代、10 代细胞，分别在培养基中加入Dox（200 ng/mL），诱导hPLN-293 细胞PLN 的表达。诱导培养48 h 后，用含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解细胞，提取总蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白电泳，转膜后，5%脱脂奶室温封闭膜2 h。以鼠来源的抗PLN 单克隆抗体作为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 作为二抗，利用蛋白免疫印迹法检测hPLN-293 细胞中PLN 的表达情况。以GAPDH 为内参，用未加Dox 诱导的相同细胞作为对照，计算PLN 相对表达量。用GraphPad Prism 5.0（美国GraphPad Software 公司）对第5、10 代各代内细胞的PLN 相对表达量进行t检验，分析细胞中PLN 表达情况并判断Dox 对于细胞中PLN 表达的影响，双侧检验水准α=0.05。

1.6 hPLN-293 细胞乌头碱染毒对Thr17-P-PLN 表达量的影响

将构建成功的hPLN-293 细胞分为染毒组和无毒组。染毒组：乌头碱终浓度为1 μmol/L、染毒时间为2 h。无毒组：不进行染毒处理。两组细胞按1.5 节步骤进行Western 印迹法检测。两组细胞中磷酸化蛋白的检验均改用含蛋白酶抑制剂和磷酸化蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解细胞，并改用BSA 封闭液封闭膜2 h。以兔来源的抗Thr17-P-PLN 单克隆抗体作为一抗，HRP 标记的羊抗兔IgG 作为二抗，以GAPDH 为内参，计算Thr17-P-PLN 相对表达量。以鼠来源的抗PLN单克隆抗体作为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 作为二抗，以GAPDH 为内参，计算PLN 相对表达量。以Thr17-P-PLN 与PLN 总蛋白表达量的比值（Thr17-PPLN/PLN）作为PLN Thr17 位点磷酸化的参考指标，用GraphPad Prism 5.0（美 国GraphPad Software 公司）对无毒组和染毒组进行配对t检验，观察乌头碱对于PLN Thr17 位点磷酸化的影响。双侧检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 hPLN-293 细胞的基因测序验证结果

从转染成功的细胞中提取基因组进行测序，测序结果与NCBI 数据库中人源性PLN 基因ORF 序列一致（图1）。

图1 转染成功的细胞中基因测序结果Fig.1 Gene sequencing results in successfully transfected cells

2.2 间接免疫荧光法检测hPLN-293 细胞中PLN 的表达

利用间接免疫荧光法对hPLN-293 细胞中PLN表达情况的检测结果（图2）显示：抗体非特异性结合（绿色荧光信号）少，说明抗体具有较好的特异性。未加Dox 诱导组显示较弱的绿色荧光信号；加入Dox 诱导组绿色荧光信号显示清晰稳定，说明hPLN-293 细胞系构建成功。

图2 间接免疫荧光法检测hPLN-293 细胞中PLN 表达Fig.2 Indirect immunofluorescence detection of PLN expression in hPLN-293 cells

2.3 hPLN-293 细胞中PLN 的表达情况

利用t检验对第1、5、10 代细胞PLN 的表达情况进行分析，结果（图3、表1）显示：第5、10 代加入Dox诱导组的PLN 表达相对于未加Dox 诱导组明显增高（P＜0.05）。

表1 Dox 诱导对hPLN-293 细胞中PLN 相对表达量的影响Tab.1 Effects of Dox induction on the relative expression of PLN in hPLN-293 cells（xˉ±s）

图3 Western 印迹法检测hPLN-293 细胞中PLN的表达量Fig.3 PLN expression in hPLN-293 cells detected by Western blot

2.4 乌头碱染毒对hPLN-293 细胞中Thr17-P-PLN表达的影响

无毒组Thr17-P-PLN/PLN 为1，染毒组的Thr17-P-PLN/PLN 为0.88±0.07（n=6），应用配对t检验进行比较，结果（图4）显示，无毒组和染毒组PLN 的Thr17位点磷酸化水平之间差异有统计学意义（P＜0.05），乌头碱染毒后hPLN-293 细胞中PLN Thr17 位点磷酸化水平降低。

图4 Western 印迹法检测乌头碱染毒对hPLN-293 细胞中PLN Thr17 位点磷酸化水平的影响Fig.4 Effects of aconitine exposure on the phosphorylation level of Thr17 site of PLN in hPLN-293 cells detected by Western blot

3 讨论

本研究采用Flp/FRT 位点特异性重组技术实现目的基因在细胞基因组转录活性区稳定持续的表达，建立的稳定表达细胞系有2 个优点：（1）由于在载体pDFT 中作为筛选标记的潮霉素B 抗性基因上游没有起始密码子ATG，只有需要插入的基因转录成功完成特异性整合后，潮霉素B 抗性基因才能在整合位点上游的起始密码子和启动子的调控下进行表达，细胞才会具有潮霉素B 抗性，而当重组质粒随机整合进基因组非FRT 位点时，筛选过程中细胞将会死亡[8-9]，通过抗生素筛选，存活的细胞都是阳性克隆。（2）所用pcDNA5/FRT/TO 载体的CMV 启动子中含有四环素操纵子序列TetO2，pDFT 载体含有FRT 位点，与pOG44载体共转染，并利用重组酶进行定向重组[9]。所选用的Flp-InTMT-RExTM293 细胞系含有四环素抑制子TetR，与启动子中的TetO2序列结合，抑制目的基因的转录[5]。转染筛选后的细胞经Dox 诱导，解除TetR 对TetO2的抑制，从而表达所需的目的蛋白。

本研究通过细胞形态、观察验证实验等方法证实，构建的hPLN-293 细胞系能够稳定表达PLN，并具有良好的表达丰度，说明导入的目的基因已经整合入载体细胞中，随着hPLN-293 细胞株的传代能够稳定表达就可以很好地应用于后续的实验。

PLN/SERCA2a 调控体系的失衡在心力衰竭[10]、急性心肌梗死[11]、扩张性心肌病[1]等心脏疾病的进展中起到重要作用。SERCA2a 表达减少和活性下降是心力衰竭的一个重要特征，因此，通过转基因等方法上调SERCA2a 表达或提高其活性成为治疗心力衰竭的一项策略[9]。有研究[10]证明，心肌缺血所造成的酸中毒和ATP 代谢障碍会抑制PLN 的活性，导致SERCA动力学受损，降低肌浆网的钙负荷，从而产生急性心肌梗死后致死性室性心律失常。hPLN-293 细胞系的构建可以促进PLN 表达干预、SERCA2a 与PLN 比值调节等研究的进展，有助于心脏疾病治疗潜在方法的探究。

PLN/SERCA2a 这一调控体系以及其上游调控蛋白CAMK2、PKA 在心脏相关的药理机制研究以及毒物相关的毒理研究中发挥着重要作用。有研究[12]报道，我国传统中药黄芪的主要活性成分黄芪皂苷Ⅳ可能通过PKA 途径增强PKA-Cα 基因及Ser16-PLN 表达，减轻缺氧/复氧所致培养心肌细胞SERCA2a 活性降低，从而减轻心肌细胞损伤。有研究[13]证实，银杏提取物EGb761 可通过影响PKA 信号通路，上调PLN磷酸化水平，解除PLN 对钙调节蛋白SERCA2a 活性的抑制，减轻细胞内钙超载的程度，改善心肌的舒张功能，从而延缓心肌细胞的老化。而常见的三氧化二砷、蒽环类药物都被指出其心脏毒理作用可能与心肌细胞的钙超载有关[14-15]。

此人源性PLN 稳定表达细胞系的构建，将为PLN表达及其磷酸化水平调节机制的研究提供有效的实验工具。利用hPLN-293 进行了乌头碱染毒的初步研究，发现乌头碱可以降低Thr17-P-PLN 磷酸化水平，提示PLN 磷酸化可能是乌头碱影响PLN/SERCA2a 调控体系、对心肌细胞的钙平衡产生影响的机制之一。同时，该细胞系的建立，也将有助于其他毒（药）物对PLN 及其磷酸化影响机制的研究。