单一及混合益生菌发酵猕猴桃果汁的香气成分分析

张 璐，梁 锦，黄天姿，王 丹，李瑞娟，杨淑霞，罗安伟

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

猕猴桃含有多种对人体有益的营养成分，具有很高的营养和保健价值，素有“VC之王”的美称，深受消费者喜爱。猕猴桃采收后极易后熟软化，常温下贮藏期短，且加工率低，产品形式单一，加工品主要有果干、果酱、果汁饮料和果酒，在干燥、熬煮及乙醇发酵等加工过程中营养成分及香气损失严重，产品香气不足、典型性不强。因此，猕猴桃加工亟需寻找新的突破口，以提高产品品质与附加值。益生菌可以帮助消化系统微生态失衡人群建立正常的菌群，益生菌发酵可以改善猕猴桃汁的香气和风味特征，提高营养成分吸收利用率，改善肠道微生态环境，清理肠道有毒物质[1]。近年来，益生菌发酵果蔬汁越来越受到消费者的青睐，郑欣等[2]利用保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌和肠膜状明串珠菌混合发酵荔枝汁，王德纯等[3]采用开菲尔菌种发酵苹果汁，Ellendersen等[4]利用干酪乳杆菌发酵苹果汁，以上研究均表明益生菌发酵具有提升果蔬汁风味、增加营养及功能成分含量等积极效果。目前，发酵果蔬汁中以植物乳杆菌和副干酪乳杆菌等益生菌的适应性较好，发酵产品的品质好[5]。

目前大部分研究侧重于单一发酵或者混合益生菌发酵果蔬汁，并没有深入比较单一益生菌发酵和混合益生菌发酵果蔬汁之间的差异性及混合益生菌发酵果蔬汁的优势。并鲜有将香气成分与香气值结合分析的文章，本研究参考香气阈值结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）结果，更加准确直观地分析比较单一和混合益生菌发酵猕猴桃果汁之间的香气成分差异。

本研究以陕西省主栽品种徐香猕猴桃为原料，采用植物乳杆菌115、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌115-副干酪乳杆菌（1∶1）复配的3种益生菌作为发酵剂，发酵制得猕猴桃益生菌果汁。以原果汁为对照，与3 组发酵猕猴桃果汁的香气成分种类及含量进行比较分析，探究单一菌种及混合菌种发酵猕猴桃果汁香气的差异，旨在为开发营养健康、香气典型的猕猴桃益生菌发酵果汁提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

徐香猕猴桃采自陕西省眉县（东经107.76°，北纬34.29°），采收时果实可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）为6.5%～7.0%，果实大小均匀、果肉饱满、无病虫害。

氢氧化钠、蒽酮、蔗糖标准液、抗坏血酸标品、环己酮、氯化钠、磷酸缓冲液（均为化学纯或分析纯）天津市天力化学试剂有限公司；果胶酶（60 U/mg）、没食子酸、芦丁 美国Sigma公司。

植物乳杆菌115（Lactobacillus plantarum115）、副干酪乳杆菌（L.paracasei） 美国杜邦公司。

GCMS-QP2010 Ultra GC-MS联用仪 日本岛津公司；手动固相微萃取装置（附带50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头） 美国Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 猕猴桃发酵果汁的制备工艺流程

猕猴桃→清洗→破碎→酶解→榨汁→过滤→成分调整→巴氏灭菌→冷却→接种→发酵→灌装→猕猴桃益生菌果汁

1.2.2 操作要点

1）果实在室温下自然后熟（SSC为（15.0±1.0）%、果肉硬度1.0 kg/cm2左右）。自来水清洗、沥水后打浆，果浆中加入0.04 g/kg果胶酶，40 ℃酶解2 h。2）用200 目尼龙纱布过滤酶解果浆得到猕猴桃果汁，加蔗糖调节SSC为（18.0±0.5）%，于75 ℃杀菌10 min。3）果汁冷却后分为4 份，3 份在无菌操作台上按照108CFU/mL接种量分别加入植物乳杆菌115、副干酪乳杆菌及植物乳杆菌115-副干酪乳杆菌（1∶1）复配的菌悬液，均在36 ℃发酵24 h，得猕猴桃益生菌发酵果汁。

1.2.3 指标测定

SSC测定：使用数显手持折射仪；总酸测定：参照曹建康等[6]的方法；多酚测定：采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸为标准物质测定多酚含量[7]；总黄酮测定：采用AlCl3显色法，以芦丁为标准物质测定类黄酮的含量[8]。

1.2.4 猕猴桃汁活菌数和感官评定的测定

活菌数：倾注平板法。

感官评定：15 名受过训练的老师和学生组成感官评定小组，从组织状态、色泽、香气、口感、滋味5 个方面对各组猕猴桃果汁进行评分，评分标准如表1所示[9]。

表1 猕猴桃益生菌果汁感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of probiotic fermented kiwifruit juice

1.2.5 发酵果汁生长曲线OD600nm值及产酸能力的测定

根据乳酸菌生长动力学的研究可知，由于菌液在OD600nm值和其显微镜计数之间存在相关关系，因此可通过测定OD600nm值评定发酵液中的活菌数[10]。OD600nm值直接用分光光度计进行测定，以原果汁为参比溶液，每隔4 h取样进行测定，重复3 次，取平均值。同时每4 h测定溶液的总酸。

1.2.6 香气成分的分析

参照马婷等[11]的方法，采用顶空固相微萃取法进行香气成分的富集。取5.0 mL猕猴桃果汁样品于20.0 mL进样瓶中，分别加入1.0 g氯化钠和0.4 mg/mL环己酮内标溶液，上机测定。进样瓶先在45 ℃平衡30 min，再用老化处理过的萃取头插入进样瓶中，顶空吸附30 min，然后进行解吸。

1.2.7 GC-MS条件

色谱条件：初温40 ℃，保持3 min，以7 ℃/min上升到200 ℃，再以10 ℃/min上升到230 ℃，保持3 min。色谱柱为DB-LMS石英毛细柱（60 m×0.25 mm，0.25 mm），载气（He）流速1.0 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流进样。

质谱条件：离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，放射电流150 μA，传输线温度230 ℃，质量扫描范围35～450 u。

1.2.8 香气分析方法

由GC-MS中NIST 14质谱数据库、匹配度和保留时间与标准谱图对照，从而对各个物质进行检索。选择相似度指数大于80的物质作为有效的香气成分。每次检测时加入相同量的内标物环己酮进行定量分析，同时结合已有的报道结果对其进行定性分析，根据面积归一化法对香气成分对应峰进行定量。

1.2.9 定性与定量

定性：香气成分利用质谱全离子扫描模式下的总离子流图谱，依据色谱保留时间和质谱信息、NIST标准谱库比对结果以及参考相关文献相结合的方法进行定性分析。

定量：采用内标法，按式（1）计算各发酵猕猴桃汁中香气物质的质量浓度：

1.3 数据处理

数据采用Origin 8.0作图，采用Excel 2010、SPSS 19.0软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃果汁理化指标测定结果

如表2所示，单一菌株发酵和混合菌株发酵与原果汁相比，总酚、总酸含量和SSC都有显著升高（P＜0.05），植物乳杆菌115、副干酪乳杆菌和混合菌种的总酚分别是原果汁的1.03、1.08、1.09 倍；总酸含量分别是原果汁的1.63、1.70、1.79 倍；SSC分别是原果汁的1.03、1.07、1.13 倍；副干酪乳杆菌和混合菌种的总黄酮含量分别是原果汁的1.06、1.07 倍。除植物乳杆菌115发酵汁中的总黄酮外，混合菌株发酵后的营养指标显著高于（P＜0.05）单一菌株，这是由于单一菌株发酵产生营养物质和功能物质的能力较弱，而混合菌株产生协同作用使发酵产物更多，发酵效率高。猕猴桃汁益生菌发酵时混合菌株发酵优于单一菌株发酵。

表2 各样品组营养指标对比Table 2 Comparison of nutritional components of fresh and fermented kiwifruit juices

2.2 猕猴桃果汁单一和混合菌株发酵过程中OD600 nm值的变化

单一和混合菌株发酵猕猴桃果汁过程中每隔4 h取样，测定3 组果汁OD600nm值的变化，如图1所示。随着发酵时间的延长，3 组果汁样品中的OD600nm值均呈现上升趋势，这与李冬华[12]研究的植物乳杆菌在圣女果汁中的生长趋势一致。发酵前8 h，各发酵组的OD600nm值上升较为缓慢，这是由于菌株在猕猴桃果汁中有一定的适应过程，处于繁殖初期，发酵产物较少。在12～20 h时，OD600nm值呈对数增加，说明此时菌株已经适应新的营养条件，利用果汁中的糖类等碳源大量增值，并产生氨基酸、短链脂肪酸等优良产物。在20 h之后，OD600nm值趋于平缓，说明已经达到了发酵终点。在12 h之后，混合菌株的生长曲线明显高于其他两株单一菌株的生长曲线，且达到发酵终点时的OD600nm值高于其他两组，说明混合菌株发酵的猕猴桃果汁中产生了更多的有益物质。且经过感官评定，发酵24 h的猕猴桃汁风味最佳，因此，后续实验中均以24 h为发酵时间。

图1 益生菌在猕猴桃果汁中的生长曲线Fig.1 Growth curves of probiotics inoculated in kiwifruit juice

2.3 单一和混合菌株发酵猕猴桃果汁中可滴定酸含量的变化

单一和混合菌株发酵猕猴桃果汁过程中每隔4 h取样，测定3 组果汁中可滴定酸含量的变化，徐香猕猴桃原汁可滴定酸质量分数为0.70%。由图2可知，随着发酵时间的延长，可滴定酸含量逐渐上升，在0～8 h之间，单一菌株和混合菌株的产酸能力相近，在8 h之后，混合菌株的产酸能力明显高于单一菌株，发酵结束时，混合菌株的产酸量达到1.28%，产酸量为单一菌株的1.1 倍，而两株单一菌株发酵的产酸能力相近，发酵结束后的产酸量也接近。在相同的发酵时间，混合菌株产酸能力高于单一菌株。

图2 益生菌在猕猴桃果汁中的产酸情况Fig.2 Acid production by probiotics inoculated in kiwifruit juice

2.4 单一和混合菌株发酵猕猴桃果汁感官评分

如表3所示，混合菌株发酵结束后测得的活菌数高于单一菌株发酵，感官评分也高于单一菌株组。如图3所示，单一菌株发酵和混合菌株发酵后果汁的色泽和组织状态差别不大，但香气、滋味混合菌株发酵显著高于单一菌株发酵（P＜0.05）。综上可知，混合菌株发酵不仅可以提升果汁中的活菌数，同时可以改善单一菌株发酵果汁后的口感和香气，因此混合菌株发酵果汁优于单一菌株发酵。

表3 各样品组发酵结果Table 3 Viable bacterial counts and sensory scores of fermented kiwifruit juices

图3 益生菌发酵猕猴桃果汁感官评分雷达图Fig.3 Radar chart of sensory scores of probiotic fermented kiwifruit juices

2.5 猕猴桃发酵果汁的香气成分分析

2.5.1 原果汁和发酵果汁的香气成分

采用GC-MS技术在4 组果汁样品中共鉴定出74种香气成分（表4），这些成分主要是包括醇类17种、酯类19种、醛类12种、酸类4种、烷烯烃类8种、酮类8种、其他类6种。其中发酵果汁和原果汁中共同的组分有醇类7种、酯类4种、酸类1种、醛类3种、酮类1种、其他类1种。混合菌种和单一菌种发酵果汁中共同的组分有醇类9种、酯类5种、酸类1种、醛类4种、酮类4种、烯烃类1种、其他类2种。

表4 原果汁和发酵果汁的香气成分Table 4 Analysis of aroma components in fresh and fermented kiwifruit juice

续表4

2.5.2 原果汁和发酵果汁中的醛类香气物质

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 组果汁中，分别检测出醛类物质6、5、5、8种，含量占香气物质总量的28.61%、11.58%、9.58%、10.97%。乙醛是乳酸菌进行糖代谢的中间产物，在各发酵组的样品中均检测出，混合菌种产生的乙醛高于单一菌种[13-14]。正己醛在原果汁中含量显著高于发酵组（P＜0.05），占香气成分总量的24.75%，可以推断正己醛是徐香猕猴桃原果汁的特征风味物质。混合菌株发酵新产生了正庚醛、壬醛、癸醛、反-2-十二烯醛4种醛类物质，占香气总量的1.28%。正庚醛和癸醛具有水果的香味，壬醛具有浓郁的玫瑰和甜橙气味，可以赋予果汁良好的花香和果香香气，香味更加馥郁。因此，这4种醛类物质是混合菌株发酵猕猴桃果汁产生的特有香气。

2.5.3 原果汁和发酵果汁中的醇类香气物质

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 组果汁中，分别检测出醇类物质11、12、11、12种，含量占香气物质总量的43.16%、60.35%、53.88%、53.33%。单一菌株和混合菌株发酵比原果汁多产生了6种新的醇类物质；在醇类香气成分中，原果汁中含量较高的物质分别为反式-2-己烯-1-醇、正己醇、桉叶油醇，含量分别占香气物质总量的10.53%、17.26%、7.23%；植物乳杆菌115发酵果汁中含量最高的醇类物质分别为正己醇、桉叶油醇、异戊醇，含量分别占香气物质总量的41.45%、5.38%、4.73%；副干酪乳杆菌发酵果汁中含量较高的醇类物质分别为正己醇、正庚醇、乙醇，含量分别占香气物质总量的44.50%、1.20%、1.55%；混合菌种发酵果汁中含量较高的醇类物质分别为正己醇、正庚醇、反式-2-己烯-1-醇，含量分别占香气物质总量的31.05%、5.97%、6.31%。3 组发酵汁中共有的物质是正己醇和正庚醇，虽然在原果汁中也含有正己醇，但是发酵组的含量显著高于原果汁（P＜0.05）；正己醇具有浓郁的水果香气，随着含量的升高，果香更浓郁、典型[15]。正庚醇具有油脂气息和辛辣香气，近似柑橘香气，天然品存在于丁香、风信子等精油中。混合菌种较单一菌种多产生了两种新的醇类物质正丁醇、4-萜烯醇，含量占香气总量的0.064%和0.30%。正丁醇具有香蕉、奶油的特殊香味[16]；4-萜烯醇具有淡的迷迭香味。因此，这2种醇类物质是混合菌种发酵猕猴桃汁产生的特征香气物质，赋予了猕猴桃发酵汁醇厚的风味和独特复杂的香气。

2.5.4 原果汁和发酵果汁中的酯类香气物质

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 组果汁中，分别检测出酯类物质10、8、11、14种，含量占香气物质总量的22.44%、16.01%、23.70%、24.21%。单一发酵和混合发酵比原果汁多产生了9种新的酯类物质，在酯类香气成分中，原果汁中含量较高的物质分别为丁酸乙酯、丁酸甲酯，含量分别占香气物质总量的11.37%、5.20%；混合菌株发酵果汁中含量较高的酯类物质分别为丁酸乙酯、苯甲酸甲酯、丁酸甲酯、乙酸己酯，含量分别占香气物质总量的7.81%、6.77%、4.04%。植物乳杆菌115发酵比原果汁多产生了乙酸己酯、乙酸戊酯、邻苯二甲酸二异丁酯；副干酪乳杆菌发酵比原果汁多产生了乙酸己酯、乙酸戊酯、乙酸乙酯、丁酸己酯；两株单一菌株发酵所产生的香气成分并不是完全一样，这是由于菌株品种的原因，每种益生菌菌株都会产生自己的特征香气，从而区分各个菌株，由此可以得出植物乳杆菌115发酵所特有的香气成分为邻苯二甲酸二异丁酯，副干酪乳杆菌发酵所特有的香气成分是乙酸乙酯和丁酸己酯。而混合菌株较单一菌株多产生的4种新的酯类物质分别为(E)-乙酸-2-己烯-1-醇酯、2-异丁基乙酰乙酸乙酯、己酸烯丙酯、癸酸甲酯，占香气总量的1.92%；乙酸己酯具有青香和果香，且具有苹果和梨的味道[17]，研究表明丁酸己酯尽管含量低但对果实风味影响很大[18]；(E)-乙酸-2-己烯-1-醇酯具有良好的糖果清香，是发酵所特有的香气成分；己酸烯丙酯是己酸和丙醛经过一系列复杂的发酵反应所得到的香气成分，具有凤梨的气味[19]；这两种酯类物质也是混合菌株发酵猕猴桃汁的特征香气。在水果和果汁中，酯类物质的种类和含量是影响其品质和香气的主要因素。由表3可知，混合菌株发酵产生的酯类物质种类和含量均高于单一菌株，赋予了果汁更加丰富的口感、香气与滋味。

2.5.5 原果汁和发酵果汁中的烷烯烃类香气物质

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 组果汁中，分别检测出烷烯烃类物质2、3、2、5种，含量占香气物质总量的2.44%、2.61%、0.96%、1.18%。单一发酵和混合发酵较原果汁多产生了6种新的烷烯烃类物质，在烷烯烃类香气成分中，原果汁中仅含有十二烷和苏合香烯；植物乳杆菌115和副干酪乳杆菌发酵较原果汁多产生了2-蒎烯、2,4-二甲基苯乙烯；而混合菌种较单一菌种多产生了萜品油烯、2-莰烯、萜品烯，萜品烯具有柑橘和柠檬香气[20-21]，萜品油烯具有独特的香料味道，据研究表明萜品油烯常用于添加饮料和果汁里的良好香料，2-蒎烯天然存在于许多精油中，如薰衣草、橙花、柠檬等，同时可以作为合成樟脑的原料，2-莰烯是由2-蒎烯在酸性作用下异构化而成，因此是发酵后产生的特征萜类物质，是混合发酵所产生的特征香气物质。

2.5.6 原果汁和发酵果汁中的酮类香气物质

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 组果汁中，分别检测出酮类物质2、6、4、8种，含量占香气物质总量的1.16%、6.64%、7.48%、7.35%。单一菌株和混合菌株发酵比原果汁多产生了6种新的酮类物质。3 组发酵果汁样品共有的酮类挥发性物质分别为2-甲基-3-戊酮、3-辛酮、香叶基丙酮。3-辛酮具有酮香、青香及淡淡的薰衣草香，并有蘑菇、干酪、水果的清香[22]，是3-辛醇经发酵所产生的特有挥发性物质；香叶基丙酮曾在芒果酒和葡萄酒中有过报道，是一种带有甜味、青草味和水果香味的挥发性香气成分[23-25]。混合菌株比单一菌株发酵多产生了2种新的酮类物质，分别为大马士酮、甲基异丙烯基甲酮，大马士酮具有强烈的玫瑰香味[26]，甲基异丙烯基甲酮具有香蕉、梨的水果香气，是合成芳樟醇的中间物质[27-28]。这两类物质赋予混合菌株发酵汁独特的香气，较单一菌株发酵的果汁，有更为浓郁的香气和滋味。

2.5.7 原果汁和发酵果汁中的酸类香气物质

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 组果汁中，均检测出酸类物质2种，含量占香气物质总量的0.44%、1.31%、1.18%、0.76%。其中混合菌株种发酵比单一菌株发酵多产生了壬酸，壬酸具有浆果香味，是辛烯与发酵产生的酸反应所得的特有挥发性物质，是混合菌株发酵的特征香气物质。

2.5.8 原果汁和发酵果汁中的其他香气物质

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 组果汁中，分别检测出其他类（胺类、酚类）物质3、3、4、3种，含量占香气物质总量的1.74%、1.50%、3.22%、2.21%。除了常见的醇类、酯类、醛酮类香气成分，猕猴桃果汁在发酵后会产生一些其他类的挥发性物质，有胺类、酚类等，这些物质的含量都很低，但是其具有的特殊香味也会为发酵果汁做出贡献。且混合菌株发酵汁中其他类物质含量明显高于单一菌株发酵汁。

2.5.9 原果汁和发酵果汁中的香气值

香气的香势可以根据其阈值的高低判断，香气阈值是指能够辨别出香气或者味道的最低浓度，阈值越低，香气的香势越强；香气值是挥发性物质的含量与该种物质的香气阈值的比值。香气值越大则对总体香气的贡献越大，香气值大于1的是对发酵猕猴桃果汁香味起主要作用的芳香成分，称为特征香气成分[15,29]。

根据已有报道的香气阈值[15,29]分析各挥发性物质的香气值见表5。4 组果汁的香气值存在一定的差异，在醛类成分中，正己醛和反式-2-己烯醛香气值远大于1，可以作为原果汁的特征香气成分[30]；在混合菌株发酵果汁中，正己醛、壬醛、癸醛香气值远大于1，可以作为其特征香气成分。在醇类成分中，正庚醇可以作为发酵果汁组的特征香气成分，叶醇在4 组样品中均被检测出，但是只有混合菌株发酵果汁的香气值大于1，因此叶醇可以作为其特征香气成分；异戊醇只有在植物乳杆菌115发酵果汁中香气值大于1，可以作为植物乳杆菌115发酵产生的特征香气成分。在酮类物质中，3-辛酮在3 组发酵果汁中均被检测出，香气值均大于1，且混合菌株发酵汁的香气值高于单一菌株发酵汁的香气值，3-辛酮也是发酵猕猴桃汁的特征挥发性物质。甲基庚烯酮只在副干酪乳杆菌发酵和混合菌株发酵果汁中的香气值大于1，可以作为其特征香气成分。

表5 原果汁和发酵果汁的主要挥发性物质的香气值Table 5 Aroma values of fresh and fermented kiwifruit juices

3 结 论

在益生菌发酵猕猴桃果汁的过程中，混合菌株的OD600nm值明显高于单一菌株，且产酸能力高于单一菌株发酵。OD600nm值大则增殖快，产生的有益风味物质多，在相同时间内混合菌种发酵果汁优于单一菌种发酵果汁。

采用GC-MS分析原果汁和发酵果汁的挥发性成分，在4 组样品中分别检测出36、39、39、53种香气物质，含量分别为15.14、18.63、17.66、32.11 mg/kg。混合菌株发酵比单一菌株发酵多产生了14种香气物质，且含量增加了13.48～14.45 mg/kg。通过对各挥发性成分的香气阈值与香气值分析，各发酵猕猴桃果汁中的特征香气成分主要有正庚醇、乙酸己酯、3-辛酮、2-蒎烯等，较单一菌株发酵而言，混合菌株发酵猕猴桃果汁产生了癸醛、壬醛、正庚醛等特征香气，这些香气化合物可以赋予猕猴桃果汁更浓郁的青香、花香和果香，风味与滋味得到改善。

综上所述，单一益生菌发酵和混合益生菌发酵在一定程度上赋予了猕猴桃果汁更丰富的口感，且混合菌株比单一菌株发酵产生了更多的营养物质和功能物质，多酚、黄酮、固形物含量及酸类物质、香气物质含量显著增加，果汁风味、香气更浓郁、典型。研究结果为开发益生菌发酵猕猴桃汁提供了理论依据。