聚乙二醇修饰β-乳球蛋白羧基对其抗原性和结构的影响

罗舜菁，吉 莉，熊绍百，钟俊桢，朱晓明，江辛琳，刘成梅,

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西省辅食营养食品工程技术研究中心，江西 赣州 341000）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛乳中主要的过敏原之一[1]，降低其致敏性对牛乳过敏人群十分必要。在针对致敏性的研究中，化学方法如糖基化[2-3]、磷酸化[4]、PEG化[5]是目前国际乳制品加工研究的热点。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰也称PEG化，是将活化的PEG分子通过共价键偶联到蛋白质或者多肽上，从而改变其理化性质的一种方法。由于无毒、无免疫原性、生物相容性良好[6]，PEG已经用于多种蛋白质和多肽药物的修饰，以降低其免疫原性，降低酶解速度，延长半衰期，保持生物活性[7-10]。研究发现PEG链在氨基酸序列上的位置以及每个蛋白质分子上连接的PEG数目对偶联物的性质均有很大影响[11]。

本课题组前期分别针对β-LG的N-末端氨基，谷氨酰胺残基（Gln）及游离巯基进行PEG修饰，探究不同修饰位点对β-LG抗原性的影响，发现不同位点修饰后β-LG的抗原性变化大相径庭，N-末端和Gln修饰后抗原性显著降低[12-13]，对游离巯基修饰后则表现为抗原性大幅度升高[14]，而目前关于羧基修饰对β-LG抗原性影响的研究鲜见报道。β-LG具有多个游离羧基，是进一步探究PEG化程度对抗原性影响的理想基团。但由于羧基数目较多，控制PEG化程度难度大，且修饰产物难以分离纯化，给相关研究造成了极大困难。本研究在前期制备获得β-LG羧基单点和两点修饰产物的基础上，使用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱对修饰产物分离纯化，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）进行鉴定，间接竞争酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）表征抗原性变化，游离巯基含量、内源荧光光谱、外源荧光光谱及圆二色谱表征结构变化，以探究PEG修饰和PEG化程度对β-LG抗原性和结构的影响以及二者间的关系，为调控β-LG的抗原性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛β-LG、猪明胶 美国Sigma公司；单甲氧基聚乙二醇酰肼（methoxypoly (ethylene glycol) hydrazide，mPEG-Hz，5 kDa） 北京键凯科技股份有限公司；BCA蛋白试剂盒、SDS-PAGE试剂盒、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔IgG二抗 北京索莱宝科技有限公司；兔抗β-LG IgG一抗、单组分超灵敏TMB显色液 北京博奥森生物技术有限公司；1-乙基-3-二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸盐（N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（N-hydroxysulfosucciniimide sodium，sulfo-NHS）北京阿拉丁生化科技股份有限公司；所有试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Mini-PROTEAN小型垂直电泳仪、NGC Quest 10 Plus中高压柱层析系统、Enrich SEC70 10 mm×300 mm凝胶柱 美国Bio-Rad公司；SP Sepharose Fast Flow色谱柱美国GE公司；Five Easy Plus pH计、ME104型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Heraeus Multifuge X1R型冷冻离心机 美国Thermo公司；Amico U1tra-15超滤离心管 美国Millipore公司；MOS 405型圆二色谱仪 法国Bio-Logic公司；F-7000荧光分光光度计日本Hitachi公司；Synergy H1酶标仪 美国BioTek公司；4800 Plus MALDI-TOF/TOFTMAnalyzer质谱仪美国AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 修饰产物的制备

羧基修饰的原理如下：

在弱酸性条件下，β-LG的氨基质子化，mPEG-Hz由于具有较低的解离常数（pKa），在EDC和sulfo-NHS的活化和助活化作用下会与蛋白质羧基选择性交联[15]。将β-LG溶于磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 4.0），质量浓度为2 mg/mL，按照β-LG、EDC、sulfo-NHS物质的量比为1∶50∶10，依次加入EDC和sulfo-NHS，混合均匀后按照β-LG与PEG物质的量比为1∶20加入mPEG-Hz（5 kDa），置于4 ℃反应过夜。

1.3.2 SDS-PAGE分析

配制12%分离胶及5%浓缩胶，取30 μL反应混合物与10 μL 4×上样缓冲液（含二硫苏糖醇）混合，煮沸5～10 min后离心1～2 min，取上清液10 μL加入样品孔，以80 V电压跑浓缩胶15 min，随后以120 V的电压跑分离胶，待溴酚蓝条带至底部时停止电泳，取出胶条于考马斯亮蓝染色液中染色1 h后脱色至蛋白条带清晰。

1.3.3 阳离子交换色谱分析

参考Zhong Junzhen等[5]的方法，使用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱对修饰产物分离纯化。使用3 倍柱体积的醋酸钠缓冲液（0.04 mol/L，pH 4.0）对离子柱平衡后上样，使用含1.0 mol/L NaCl的醋酸钠缓冲液（0.04 mol/L，pH 4.0）0%～100%对样品线性梯度洗脱150 min，流速2 mL/min，在280 nm波长处测定吸光度。产物的修饰率通过层析系统自带软件计算，计算如式（1）所示：

1.3.4 凝胶过滤色谱分析

使用Enrich SEC70 10 mm×300 mm凝胶柱对修饰产物纯度进行分析。使用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH 7.0）平衡凝胶柱，待基线水平且电导率保持不变后，上样0.2 mL进行洗脱，流速1 mL/min，于280 nm波长处检测吸光度。

1.3.5 MALDI-TOF-MS分析

使用4800 Plus MALDI-TOF/TOF质谱仪对修饰前后β-LG的分子质量进行分析鉴定。取1 μL样品点至样品靶上自然干燥，再取1 μLα-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液点至对应靶位上自然干燥，同样的方法在相邻靶位上点校准标准品（4700 Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1）。采用校准标准品进行外标一级校准，波长349 nm，电压2 kV，在正离子，线性模式下进行检测，扫描范围5 000～50 000 Da，质量误差小于0.5 Da，数据通过软件Data Explorer V4.5进行分析。

1.3.6 抗原性分析

参考Meng Xuanyi等[16]的方法，用间接竞争ELISA法对修饰产物与抗体的结合能力进行分析测定，通过半抑制浓度（IC50）表征产物抗原性变化。1）包被：在96 孔酶标板中每孔加入100 μLβ-LG（2.5 μg/mL）作为包被抗原，4 ℃过夜；2）封阻：次日用含0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲溶液（phosphate-buffered saline Tween-20，PBST）重复洗涤扣干3 次，每孔加入250 μL 1%猪明胶进行封阻，37 ℃孵育1 h；3）竞争抑制：另一酶标板以同一方法封阻，洗涤后每孔分别加入60 μL不同质量浓度（0.1、2.5、5、10、15、25、50 μg/mL）的竞争抗原（mono-PEG-β-LG、di-PEG-β-LG、未修饰β-LG）和等体积兔抗β-LG IgG一抗（1∶35 000稀释），用PBST代替竞争抗原作空白对照，37 ℃孵育1 h，每孔取100 μL转移至第一块板内进行竞争，37 ℃孵育1 h；4）二抗反应：洗涤扣干后每孔加入HRP标记的羊抗兔IgG酶标二抗（1∶5 000稀释）100 μL，37 ℃孵育1 h；5）显色终止：洗涤后每孔加100 μL单组分TMB显色液，37 ℃避光25 min后加入等体积终止液终止反应；6）检测计算：5 min后于450 nm波长处检测OD值。以修饰产物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，计算IC50值，表征修饰产物抗原性变化。抑制率计算如式（2）所示：

式中：B为竞争抗原对应的OD值；B0为空白对照孔的OD值。

1.3.7 游离巯基含量分析

使用Ellmans’ DTNB法[17]对修饰前后样品的游离巯基含量进行测定。取1 mL待测蛋白溶液（1.0 mg/mL）加入到4 mL Tris-Gly缓冲溶液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、5 mmol/L EDTA，pH 8.0）中，加入50 μL Ellmans’试剂（4 mg/mL），37 ℃反应20 min后使用Synergy H1酶标仪于412 nm波长处检测吸光度。游离巯基含量计算如式（3）所示：

式中：A412nm为样品在412 nm处的吸光度；D为稀释倍数；C为样品质量浓度/（mg/mL）。

1.3.8 表面疏水性分析

以1-氨基萘-8-磺酸（1-anilinonaphthalene-8-sulfonate，ANS）为荧光探针，使用荧光分光光度计对修饰前后β-LG的表面疏水性进行分析。PBS溶液（10 mmol/L，pH 7.0）稀释样品至0.1 mg/mL，取4 mL样品与20 μL ANS（8 mmol/L）混合，避光反应5～10 min，激发波长370 nm，发射波长400～600 nm，狭缝宽度5 nm，扫描速率1 200 nm/min，以PBS替代样品作空白对照。

1.3.9 内源荧光光谱分析

使用荧光分光光度计分析修饰前后β-LG内源荧光强度的变化。10 mmol/L PBS溶液（pH 7.0）稀释样品至0.1 mg/mL，激发波长为280 nm，扫描发射波长范围300～450 nm，狭缝宽度2.5 nm，扫描速率1 200 nm/min，重复扫描3 次。

1.3.10 圆二色谱分析

使用圆二色谱仪对修饰产物的二级结构组成及含量进行分析。样品质量浓度0.1 mg/mL，使用石英比色皿于25 ℃在氮气环境下检测，扫描范围190～250 nm，步进分辨率1 nm，谱带宽度1 nm，扫描速率100 nm/min，重复扫描3 次。通过在线网站Dichroism Website分析拟合圆二图谱并计算二级结构相对含量。

1.4 数据统计与分析

使用Origin 8.5软件作图，SPSS 17.0软件分析数据显著性（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 产物分离纯化及修饰率检测

等电点是离子交换层析的重要依据。β-LG分子质量为18.3 kDa，等电点在5.1～5.3之间[18]，在醋酸钠（40 mmol/L，pH 4.0）缓冲体系中带正电，与带负电的阳离子交换树脂结合。使用含1.0 mol/L NaCl的醋酸钠缓冲液（40 mmol/L，pH 4.0）在0%～100%进行线性梯度洗脱，结果如图1A所示，得到3 个明显的洗脱峰F1、F2和F3。带正电的β-LG与不带电的PEG分子结合减弱了蛋白质与吸附表面之间的静电作用，使其与离子柱结合能力降低，PEG化程度越高，结合能力越弱[19]，洗脱所需的盐浓度越低，因而PEG修饰产物先于未修饰的β-LG被洗脱。推测峰F1和F2为两种修饰产物的洗脱峰，且F1的PEG化程度高于F2，F3为未修饰的β-LG。

图1 PEG修饰混合物的阳离子交换色谱图（A）和纯化得到的各洗脱峰SDS-PAGE图（B）Fig.1 Cation exchange chromatogram of PEGylation mixture (A) and SDS-PAGE analysis of elution peaks obtained from purification (B)

本研究采用的mPEG-Hz会在EDC和sulfo-NHS的助活化作用下与蛋白质羧基选择性交联。收集洗脱峰进行SDS-PAGE分析，如图1B所示，峰F3位于18 kDa左右，与β-LG分子质量相同，保留时间最短的峰F1在34～43 kDa之间有一条带，F2在26～34 kDa之间有一条带，修饰后β-LG分子质量显著增加，通过层析系统自带软件分析，产物的总修饰率为82.91%。

2.2 修饰产物纯度分析

因F1和F2未完全分开，分别大量收集F1峰前及F2峰后，用截留分子质量10 kDa的Amico Ultra-15超滤离心管于4 ℃、6 000 r/min离心20 min，用10 mmol/L PBS（pH 7.0）对样品中溶液进行置换。利用凝胶柱的分子筛作用，各物质按照分子质量递减顺序洗脱，对修饰产物纯度进行鉴定。如图2所示，两种产物的洗脱峰均窄而尖，峰F1的浓缩样品纯度高达98.61%（图2A），峰F2的浓缩样品纯度高达99.66%（图2B），表明成功制备纯度均在95%以上的两种PEG修饰产物。

图2 PEG修饰产物的凝胶过滤色谱图Fig.2 Gel filtration chromatogram of PEGylation products

2.3 修饰产物的鉴定

2.3.1 SDS-PAGE分析

大量收集两种修饰产物并浓缩，稀释4 倍后进行SDS-PAGE分析。如图3所示，泳道2和3分别在26～34 kDa之间和34～43 kDa之间具有一条明显的条带，表明阳离子交换柱分离效果较好。

图3 PEG修饰产物的SDS-PAGE图Fig.3 SDS-PAGE analysis of PEGylation products

溶液中PEG分子的乙氧基会结合水分子，使PEG修饰产物的流体力学体积增大，因而修饰产物的表观分子质量是未修饰蛋白的分子质量与2.5 倍PEG分子质量之和[20]，泳道2的表观分子质量是β-LG分子质量与单个2.5 倍PEG分子质量（5 kDa）之和，泳道3对应的是β-LG分子质量与两个2.5 倍PEG分子质量（5 kDa）之和，表明泳道2（峰F2）和3（峰F1）分别为mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG。

2.3.2 MALDI-TOF-MS分析

为进一步鉴定两种修饰产物，使用MALDI-TOF-MS对β-LG及修饰产物的实际分子质量进行测定。

如图4所示，β-LG标准品分子质量为18.3 kDa（图4A），两种修饰产物的分子质量分别为23.3 kDa（β-LG分子质量与一个PEG分子质量之和）和28.6 kDa（β-LG分子质量与两个PEG分子质量之和），进一步证明纯化得到的PEG修饰产物为mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG。

图4 PEG修饰产物的MALDI-TOF-MS图Fig.4 MALDI-TOF-MS analysis of PEGylation products

2.4 抗原性检测结果

在间接竞争ELISA中，使用IC50值表征修饰产物与抗体的结合能力，IC50值越高，表明达到IC50值所需竞争抗原越多，即竞争抗原与抗体的结合能力越弱，修饰产物抗原性越弱[21]。如图5所示，β-LG的IC50值最低，为1.90 μg/mL，mono-PEG-β-LG的IC50值为2.47 μg/mL，是β-LG的1.30 倍，而di-PEG-β-LG高达10.41 μg/mL，为β-LG的5.48 倍，表明PEG修饰后β-LG的抗原性显著降低，且提高PEG化程度可以极显著降低其抗原性。

图5 PEG修饰产物的抗原性变化图Fig.5 Changes in antigenicity of PEGylation products

研究表明，β-LG的抗原性取决于线性致敏表位和构象致敏表位，而致敏表位与结构变化密切相关[22]。本团队前期研究发现，游离巯基修饰后β-LG抗原性升高的可能原因是由于结构变化导致新致敏表位形成[14]，而N-末端及Gln修饰后抗原性降低的可能原因是PEG分子遮蔽了β-LG抗原性表位[12,23]。为明确羧基修饰后β-LG抗原性降低的原因，实验需对修饰产物的结构变化进行分析。

2.5 游离巯基含量分析

巯基对维持蛋白质结构意义重大，每个β-LG单体含有5 个半胱氨酸残基（Cys），其中Cys66和Cys160、Cys106和Cys160分别形成两个二硫键，而游离巯基Cys121包埋于分子内部[24]。修饰产物游离巯基含量如图6所示，PEG修饰后，β-LG的游离巯基含量由52.54 μmol/g分别下降至42.70 μmol/g（mono-PEG-β-LG）和37.97 μmol/g（di-PEG-β-LG）。由于PEG链具有空间屏蔽作用[25]，可能会对Cys121造成遮蔽，PEG化程度越高，遮蔽作用越强，检测到的游离巯基含量越低，抗原性降低越显著。

图6 PEG修饰产物的游离巯基含量分析Fig.6 Free sulfhydryl content analysis of PEGylation products

2.6 表面疏水性分析

表面疏水性与蛋白质的构象、稳定性及抗原性变化密切相关[26]。以ANS为荧光探针，通过与蛋白质表面暴露的疏水性氨基酸结合表征表面疏水性变化[16]。如图7所示，β-LG的最大荧光强度为1 821，两种修饰产物荧光强度分别为2 067和2 114，表明PEG修饰后β-LG的表面疏水性增强，且di-PEG-β-LG略高于mono-PEG-β-LG。

图7 PEG修饰产物的表面疏水性分析Fig.7 Surface hydrophobicity analysis of PEGylation products

β-LG分子内部具有大量疏水性氨基酸[27]，在PEG结合过程中，β-LG三级结构展开，包埋于分子内部的疏水性氨基酸暴露于极性溶液中，使ANS与蛋白质的结合能力提高[28]，导致表面疏水性增强；另一方面，PEG链具有很强的遮蔽作用[19]，因此表现为mono-PEG-β-LG与di-PEG-β-LG表面疏水性没有显著区别。

2.7 内源荧光光谱分析

在内源荧光光谱分析中，常以色氨酸（Trp）为荧光探针，通过描述其所处微环境考察蛋白质结构变化。修饰后β-LG内源荧光光谱变化如图8所示，β-LG在333 nm波长处最大内源荧光强度为2 495，mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的内源荧光强度分别为2 382和2 340，随PEG化程度的升高，修饰产物荧光强度降低，最大发射波长未发生明显红移或蓝移。

图8 PEG修饰产物的内源荧光光谱分析Fig.8 Intrinsic fluorescence spectra of PEGylation products

研究表明，位于疏水环境中的Trp暴露于极性溶剂中会发生荧光猝灭[29]，因此PEG的接入可能导致β-LG的三级结构展开，分子内部19Trp和61Trp暴露于溶剂中[30]，使荧光强度降低。mono-PEG-β-LG与di-PEG-β-LG的荧光强度没有显著区别，可能是由于尽管后者Trp暴露更多，但多个PEG链的屏蔽作用导致荧光强度变化不大。三级结构展开造成构象表位破坏，以及PEG的空间位阻效应导致修饰产物抗原性降低。

2.8 二级结构分析

通过圆二色谱分析PEG修饰对β-LG二级结构的影响，结果如图9所示。β-LG是一个以β-折叠为主的蛋白，8 条反向平行的β-折叠在蛋白疏水内部形成桶状结构，桶外是一条具有3 个β-转角的α-螺旋和第9条β-折叠链[31]。192 nm波长处的正吸收峰、208 nm和222 nm波长附近的负吸收峰是α-螺旋的显著特征；190～200 nm波长处的正谱带及216～218 nm波长处的负峰是β-折叠的显著特征。

图9 PEG修饰产物的二级结构变化Fig.9 Circular dichroism spectra of PEGylation products

如表1所示，与未修饰的β-LG相比，mono-PEG-β-LG的二级结构没有发生显著变化；而di-PEG-β-LG的二级结构发生变化，表现为α-螺旋相对含量显著降低，无规卷曲相对含量显著升高，说明在di-PEG-β-LG形成过程中β-LG的二级结构展开，构象致敏表位破坏程度加剧。

表1 PEG修饰产物的二级结构相对含量变化Table 1 Changes in secondary structure contents in PEGylated products%

3 结 论

采用mPEG-Hz（5 kDa）对β-LG羧基共价修饰，制备不同PEG化程度的产物，总修饰率为82.91%。对修饰产物进行分离纯化，获得纯度分别为99.66%和98.61%两种主要修饰产物；SDS-PAGE及MALDI-TOF-MS鉴定产物分子质量分别为23.3 kDa和28.6 kDa，表明修饰产物分别为mono-PEG-β-LG及di-PEG-β-LG。

β-LG、mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的IC50分别为1.90、2.47 μg/mL和10.41 μg/mL，mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的IC50值分别是β-LG的1.30 倍和5.48 倍，表明羧基修饰后β-LG的抗原性显著降低，且提高PEG化程度可以极显著降低β-LG的抗原性。两种修饰产物的游离巯基含量分别为42.70 μmol/g和37.97 μmol/g，表明随着PEG化程度增强，结合的PEG分子增多，遮蔽作用增强；相比于mono-PEG-β-LG仅发生三级结构的变化，di-PEG-β-LG的二级结构也发生变化（α-螺旋相对含量显著降低，无规卷曲相对含量显著升高），表明随着PEG化程度增强，β-LG的空间结构改变，可能导致构象表位破坏加剧。在PEG分子的遮蔽和空间位阻效应以及构象致敏表位破坏两重作用下，di-PEG-β-LG的抗原性发生了极显著的降低。

因此后续研究可以通过以下两种方法进一步降低β-LG的抗原性：1）通过条件优化等方法提高PEG化程度，增强对线性致敏表位的遮蔽及空间位阻作用；2）使用物理化学等方法改变β-LG结构，加剧破坏构象致敏表位。为深入探究β-LG抗原性变化的机理，还需对PEG结合位点进行分析鉴定，明晰抗原性变化与结构变化，结合位点之间的关系。