LncRNA HNF1A- AS1 与CgA 在胃肠胰神经内分泌肿瘤患者血清中的表达及其临床意义

李杰玉，林玉玲，刘琳，金文波

（南阳市中心医院内分泌科，河南 南阳 473000）

胃肠胰神经内分泌肿瘤（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms，GEP-NENs）是发生于消化系统的神经内分泌肿瘤，不同患者的临床表现不同且预后较差[1]。 近年来，GEP-NENs 发病率逐年升高，患病早期无明显症状，临床主要采用影像学与内镜检查等手段进行诊断，但漏诊率与误诊率较高，研究表明影像学与肿瘤特异性标志物联合检测可提高GEP-NENs 的诊断准确率[2-4]。 目前GEP-NENs 的发病机制尚未阐明，因而积极探寻新型分子标志物有助于提高GEP-NENs 的诊断效率及改善患者预后。 长链非编码RNA 肝细胞核因子1 alpha 反义链1（long non-coding RNA hepatocyte nuclear factor 1 alpha-antisense 1，LncRNA HNF1A-AS1）在GEP-NENs 组织中的表达水平降低，并可能参与GEP-NENs 发生及发展过程[5]。 但HNF1AAS1 对GEP-NENs 的诊断价值尚未阐明。 目前已有研究证实LncRNA 如MEG3、PCAT1、SNHG16 等在血清中可以被检测，并被认为可作为肿瘤早期筛查的方法[6,7]。 而探索通过血液检测是否能对GEP-NENs 进行早期筛查或诊断，同时相较组织学检测发挥简单、快速、无侵袭性的优势具有重要临床意义。 嗜铬粒蛋白A (chromogranin A,CgA)在GEP-NENs 患者血清中表达水平升高，并可能作为诊断标志物[8]。 但血清HNF1A-AS1 与CgA 水平对GEP-NENs 的诊断价值尚未可知。本研究通过检测GEP-NENs 患者血清中HNF1A-AS1 与CgA 水平，分析其与患者临床病理特征及其预后的相关性，探讨二者联合检测对GEP-NENs 的诊断效能，旨在为寻找GEP-NENs 诊断及治疗的有效标志物提供新方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年1月至2017年12月本院收集的GEP-NENs 患者70 例为GEP-NENs组，所有患者均经病理检查证实为GEP-NENs，收集患者临床病理参数，包括年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤发生部位等，其中肿瘤分级诊断标准符合相关诊断标准[9]。 所有患者术前均进行影像学诊断指标。 排除标准：临床资料不完整者；依从性较差者。同时选取同期本院健康体检中心的志愿者60 例为对照组。GEP-NENs 组患者中男56 例，女14 例，年龄46～68岁，平均年龄61.37±6.78岁。 对照组中男36 例,女24 例,年50～70岁，平均年龄63.37±7.16岁。 两组患者年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 本研究经本院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 采集样本 所有受试者均禁食12h，次日清晨抽取空腹静脉血5ml 置于抗凝试管内，4℃条件下经3000r/min 转速离心10min，吸取上清血清，置于-20℃冰箱内保存。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测HNF1A-AS1 的表达水平 采用Trizol 法（美国Invitrogen 公司）提取血清中总RNA，利用紫外分光光度计（公司）测定RNA 浓度，参照反转录试剂盒（上海联迈生物工程有限公司） 说明书将RNA 反转录为cDNA。 HNF 1A-AS1 上游引物5’-TCAAGAAATGGTGGCTAT-3’，下游引物5’-GATCTGAGACTGGCTGAA-3’；GAPDH 上游引物5’-ACAGTCAGCCGCATCTTC TT-3’，下游引物5’-GACAAGCTTCCCT TCTCAG-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。 以cDNA 为模板进行qRT-PCR 扩增，严格按照荧光定量PCR 试剂盒（北京天根生化科技有限公司） 说明书进行操作。 反应体系：SYBR Green Master Mix 10μl, 上 下游引 物0.8μl，cDNA 1μl，ddH2O 补足体系至25μl。 反应条件：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延 伸30s，共循环40 次。 HNF1A-AS1 以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算HNF1A-AS1 的相对表达量。

1.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中CgA水平 采用ELISA 检测血清中CgA 水平，检测试剂盒购自泉州市睿信生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 随访 采用电话、 门诊复查等方式对所有患者进行随访，随访时间从患者经病理组织检查确诊为GEP-NENs 开始，截止时间为2018年10月，统计患者总体生存率。

1.3 统计学处理 采用统计学软件SPSS22.0 对数据进行分析，计量资料符合正态分布的数据均以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析； 计数资料用[n（%）]表示，采用检验；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清HNF1A-AS1、CgA 水平对GEP-NENs 的诊断价值；采用Kaplan-Meier 对患者3年生存情况进行分析；Cox 比例风险模型 （cox proportional-hazards model） 分析影响患者预后的危险因素，各组数据P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA HNF1A-AS1 与CgA 在GEP-NENs患者中的表达水平 与对照组相比，GEP-NENs 组患者血清中HNF1A-AS1 的表达水平显著降低（P＜0.05），CgA 的水平显著升高（P＜0.05），见表1。

表1 LncRNA HNF1A- AS1 与CgA 在GEP- NENs 患者中的表达水平（±s）

表1 LncRNA HNF1A- AS1 与CgA 在GEP- NENs 患者中的表达水平（±s）

组别对照组GEP-NENs 组n HNF1A-AS1 60 70 t P 1.00±0.10 0.46±0.11 29.091 0.000 CgA（μg/L）46.35±9.68 95.74±12.52 24.844 0.000

2.2 HNF1A-AS1、CgA 表达水平与患者临床病理特征的相关性 根据HNF1A-AS1 与CgA 表达水平的平均值分别将患者分为HNF1A-AS1 高表达组30 例，低表达组40 例；CgA 高表达组45 例，低表达组25 例，观察HNF1A-AS1、CgA 表达量与患者临床病理特征的相关性，结果显示HNF1AAS1、CgA 表达量与浸润深度、肿瘤分级、淋巴结转移有关（P＜0.05），而与年龄、性别、发生部位、肿瘤直径无明显相关性（P＞0.05），见表2。

表2 HNF1A- AS1、CgA 表达水平与患者临床病理特征的相关性[例（%）]

2.3 血清HNF1A-AS1、CgA 水平对GEP-NENs 的诊断价值ROC 分析血清HNF1A-AS1、CgA 水平对GEP-NENs 的诊断价值，HNF1A-AS1 诊断时灵敏度为85.7%,特异度为50.0%,AUC 面积为0.644,95%CI：0.556～0.726，截断值为0.908。 CgA 诊断时灵敏度为61.4%, 特异度为73.3%,AUC 面积为0.651，95%CI：0.563～0.733，截断值为74.76。 联合检测时灵敏度为88.6%，特异度为90.0%，AUC 面积为0.945，95%CI：0.891～0.977，联合检测时灵敏度与特异度明显高于各单项检测，见图1。

图1 ROC 分析血清HNF1A- AS1、CgA 水平对GEP- NENs 的诊断价值

2.4 血清HNF1A-AS1、CgA 水平与GEP-NENs 患者预后的相关性Kaplan-Meier 分析显示HNF1A-AS1 高表达组总体生存率（56.74%）高于低表达组（20.03%）（P ＜0.05）；CgA高表达组总体生存率（36.47%）低于低表达组（62.38%）（P＜0.05），见图2。

图2 血清HNF1A- AS1、CgA 水平与GEP- NENs 患者总生存率的相关性分析

2.5 影响GEP-NENs 患者预后的COX 分析 采用COX 比例风险模型分析影响GEP-NENs 患者预后的相关因素，结果显示高度肿瘤分级、淋巴结转移、HNF1A-AS1 表达量降低与CgA 水平升高是影响GEP-NENs 患者预后的危险因素（P＜0.05），见表3。

表3 影响GEP- NENs 患者预后的COX 分析

3 讨论

LncRNA 在胃癌等多种肿瘤中异常表达并可参与肿瘤发生及发展过程，研究表明部分LncRNA还可作为肿瘤诊断的分子标记物[10,11]。 因而探寻G EP-NENs 发生发展相关的LncRNA 具有重要意义。

HNF1A-AS1 在膀胱癌等多种肿瘤中呈高表达，沉默HNF1A-AS1 表达可抑制肿瘤细胞迁移及侵袭[12,13]。 但相关报道指出HNF1A-AS1 在胃癌、胰腺癌等肿瘤组织中呈低表达，并可参与肿瘤发生及发展过程[14,15]。 本研究结果显示HNF1A-AS1 在GEP-NENs 患者血清中表达下调，与相关文献报道相似。 提示HNF1A-AS1 表达量降低可能促进GEP-NENs 的发生。 进一步分析显示HNF1A-AS1表达量降低与患者浸润深度、肿瘤分级、淋巴结转移有关，提示随着HNF1A-AS1 表达量降低患者疾病严重程度明显增加。 本研究通过ROC 分析显示HNF1A-AS1 对GEP-NENs 的灵敏度较高，但特异性较低。

CgA 是神经内分泌细胞分泌颗粒的重要成分，其在肿瘤中呈高表达并可作为神经内分泌细胞的特异性标志物，既往研究显示CgA 表达水平升高可能促进GEP-NENs 的发生，CgA 与其他指标联合检测可在一定程度上提高诊断效果[16-20]。 与上述研究结果相似，本研究结果显示CgA 在GEPNENs 患者血清中呈高表达，CgA 表达量与浸润深度、肿瘤分级、淋巴结转移有关，提示血清CgA 水平升高可能促进GEP-NENs 的发生及发展。 本研究结果显示血清CgA 诊断GEP-NENs 的特异度明显高于HNF1A-AS1，但灵敏度明显低于HNF1AAS1，进一步分析显示联合检测时灵敏度与特异度明显高于单独检测，提示HNF1A-AS1 与CgA 联合检测GEP-NENs 的诊断效能更佳。 同时本研究结果显示HNF1A-AS1 表达量降低与CgA 水平升高时患者生存率降低，HNF1A-AS1 表达量升高与CgA 水平降低时患者生存率升高，提示血清HNF1A-AS1、CgA 水平与患者预后有关。 进一步通过COX 分析显示高度肿瘤分级、 淋巴结转移、HNF1A-AS1 表达量降低与CgA 水平升高是影响GEP-NENs 患者预后的危险因素。 提示HNF1AAS1 表达量降低与CgA 水平升高预示患者预后不良。

综上所述，GEP-NENs 患者血清HNF1A-AS1表达显著降低，CgA 显著升高，且与患者临床病理特征及预后密切相关，二者联合检测可提高对GEP-NENs 的诊断效能，可能成为GEP-NENs 治疗的潜在靶点。