大黄泄浊方对5/6肾切除大鼠肾组织中内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP表达的影响*

河北中医学院第一附属医院

张欣欣 辛 鑫 吴振华 檀 淼△ 杨凤文 张翠轻 陈素枝 袁国栋 檀金川(石家庄 050011)

提要 目的：通过研究大黄泄浊方对5/6肾切除大鼠肾组织中内质网应激(ERS)相关蛋白的影响，探讨其保护肾功能延缓肾间质纤维化(RIF)的作用机制。方法：90只健康SD雄性大鼠随机分为假手术组，模型组，大黄泄浊方低、中、高剂量(6.825、13.650、27.300 g/kg)组和尿毒清颗粒组(2.600 g/kg)。除假手术组外，其余均采用5/6肾切除手术诱导慢性肾衰竭(CRF)大鼠模型。模型诱导成功后，各药物干预组分别予规定剂量的药物混悬液灌胃，每日1次，连续8周。给药结束后，检测大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)水平和24 h尿蛋白定量(UTP)；Masson染色观察RIF程度；免疫组织化学法检测肾组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达情况。结果：与假手术组相比，模型组大鼠血Scr、BUN、UTP水平显著增高(P<0.05)，肾间质发生显著纤维化，GRP78、CHOP蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；与模型组相比，大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组血Scr、BUN、UTP水平具有不同程度降低(P<0.05)，RIF不同程度改善，GRP78、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论：大黄泄浊方可减轻5/6肾切除术诱导的CRF大鼠肾功能恶化、改善RIF病理改变，其机制可能与降低GRP78、CHOP蛋白表达以抑制ERS有关。

肾间质纤维化(RIF)是各种肾脏疾病进展到一定阶段表现出的共同病理特征，是肾脏结构损害和肾功能障碍的重要原因之一[1- 2]。减轻RIF病理进程对于减缓慢性肾衰竭(CRF)进展和保护肾功能具有十分重要的意义。内质网应激(ERS)在RIF进程中扮有重要角色[3]，适度的ERS对于维持内质网稳态、细胞存活和延缓RIF至关重要；但过强的ERS会诱导肾脏实质细胞发生凋亡，增加肾脏结构不可逆性损伤，进而加速了RIF的进展[4]。

中药复方在延缓肾纤维化、减轻肾损伤和延缓肾衰进程方面具有显著疗效[5-7]。大黄泄浊方(由大黄、黄芪、土茯苓、水牛角丝、丹参、当归、醋龟甲、地龙、积雪草组成)是导师檀金川教授治疗CRF的常用中药复方，目前已经成为河北省中医院院内制剂，组方针对CRF患者“脾肾亏虚、湿热瘀蕴结”特点，具有健脾益肾、清热利湿、化瘀通络、泄浊解毒的功效，临床应用时发现在改善患者肾衰症状、降低血肌酐(Scr)和降低尿蛋白等方面均取得较好的疗效，但具体的作用机制尚不明确。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白是ERS相关蛋白，本研究通过观察大黄泄浊方对CRF大鼠肾组织中ERS相关蛋白GRP78、CHOP表达的影响，探讨其保护肾功能延缓RIF的作用机制，以期为其临床运用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级健康SD雄性大鼠[(6～8周龄、体质量(160±20)g]90只，辽宁长生生物技术有限公司提供[许可证书编号SCXK(辽)2020-0001]；在河北中医学院SPF级实验动物中心饲养，自由饮水及进食。

1.2 药物 大黄泄浊方所有药材均来自于河北省中医院中药房，中药配方颗粒由广东一方制药有限公司提供(药物批号：大黄0060243、黄芪0071088、土茯苓0080923、水牛角丝0066623、丹参0071563、当归0070963、醋龟甲0076823、地龙0057083、积雪草0055443)，中药颗粒中生药含量分别为大黄10 g、黄芪25 g、土茯苓20 g、水牛角丝15 g、丹参12 g、当归10 g、醋龟甲15 g、地龙9 g、积雪草15 g；尿毒清颗粒(5 g×18袋，由内蒙古康臣药业有限责任公司生产，国药准字Z20073256)。

1.3 主要试剂及仪器 血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白定量(UTP)检测试剂盒，购自南京建成生物；马松(Masson)染色液，购自北京雷根生物科技有限公司；CHOP、GRP78一抗，分别购自美国affinity公司和美国abcam公司；二抗，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；BX53显微镜，日本奥林巴斯公司；RM2015型切片机，德国Leica公司；7170A全自动生化仪，日本日立公司。

2 方法

2.1 模型制备 按照5/6肾切除法制备CRF大鼠模型[8]。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，将其固定于手术操作台上，左侧背部剔毛、备皮、常规消毒，距左肋脊角1.5 cm处做一纵向皮肤切口(长约3 cm)，逐层分离皮肤、皮下组织、脂肪肌肉等各层进入后腹腔，暴露左侧肾脏，动脉夹结扎肾蒂，切除以肾皮质为主的2/3肾组织，明胶海绵垫压迫止血，复位肾脏，缝合切口并进行包扎，为预防感染，术后腹腔注射青霉素。1周后进行第2次手术，按照上述方法行右肾全切术。术后4周，随机抽取2只假手术组和2只造模组化验检测Scr、BUN、UTP水平，造模组较假手术组比较血Scr、BUN和UTP含量明显增加，处死大鼠并留取肾脏标本进行Masson染色观察肾间质纤维化程度，造模组大鼠肾间质有明显的纤维化，提示模型制备成功[6,8]。

2.2 分组及给药 90只健康的SD雄性大鼠采用随机数字表法随机分为假手术组，模型组，大黄泄浊方组(低、中、高)，尿毒清颗粒组，每组均15只。假手术组仅做双肾被膜剥离术，其余5组均按照2.1方法制备CRF大鼠模型，模型复制成功后，各给药组均按照相应剂量灌胃治疗。依据人与大鼠体表面积折算法计算大鼠的临床等效剂量，大黄泄浊方中剂量给药量为13.65 g/kg·d-1，中剂量的1/2、2倍分别为低剂量(6.825 g/kg·d-1)、高剂量(27.300 g/kg·d-1)，尿毒清颗粒组给药量为2.600 g/kg·d-1，以大鼠10 mL/kg的体质量标准灌胃给药，每日1次，连续给药8周。假手术组、模型组在同等时间点给予同等剂量的蒸馏水灌胃。

2.3 指标检测

2.3.1 血Scr、BUN及UTP定量的检测: 全自动生化分析仪检测大鼠血清中BUN、Scr水平，尿液分析仪检测UTP水平。均严格按照试剂盒的要求进行。

2.3.2 Masson染色检测肾脏病理学改变：将固定于4%多聚甲醛中的肾组织取出，进行脱水、透明组织、石蜡包埋，连续切片(厚度为4 μm)，进行Masson染色，光学显微镜下观察肾脏胶原纤维沉积情况。

2.3.3 免疫组织化学法检测GRP78、CHOP蛋白的表达情况：取肾组织切片，脱蜡、水化、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，加入稀释好的一抗，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次后滴加稀释好的二抗，37 ℃孵育。PBS清洗，DAB染色避光显色，在显微镜下观察棕褐色染色为蛋白的阳性表达后水洗、复染、脱水、透明和封片。使用image Pro plus 6.0软件进行结果分析。

3 结果

3.1 大黄泄浊方对CRF大鼠血Scr、BUN及UTP水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠血Scr、BUN、UTP水平显著增高(P<0.05)；与模型组相比，各给药物组大鼠血Scr、BUN、UTP水平均有不同程度下降(P<0.05)，其中大黄泄浊方中、高剂量组疗效明显优于大黄泄浊方低剂量组和尿毒清颗粒组(P<0.05)。详见表1。

表1 大黄泄浊方对CRF大鼠Scr、BUN及24 hUTP水平的影响

3.2 大黄泄浊方对CRF大鼠RIF的影响 与假手术组相比，模型组大鼠肾组织中可见大量胶原纤维沉积；与模型组相比，大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组各肾组织中胶原纤维沉积情况有不同程度改善，其中以大黄泄浊方中、高剂量组改善明显。见图1。

注：A.假手术组；B.模型组；C.低剂量组；D.中剂量组；E.高剂量组；F.尿毒清颗粒组。(图2、图3同)

3.3 大黄泄浊方对CRF大鼠肾组织中GRP78、CHOP蛋白表达的影响 GRP78、CHOP在正常肾组织中少量表达，肾小管上皮细胞为阳性主要表达部位；与假手术组相比，模型组大鼠肾组织中GRP78、CHOP蛋白表达含量明显升高(P<0.05)；与模型组相比，大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组大鼠肾组织中GRP78、CHOP蛋白表达含量均有不同程度降低(P<0.05)，其中大黄泄浊方中、高剂量组大鼠肾小管中GRP78、CHOP蛋白表达量降低程度明显优于大黄泄浊方低剂量组和尿毒清颗粒组(P<0.05)。详见表2、图2、图3。

图2 大黄泄浊方对CRF大鼠肾组织中GRP78蛋白表达的影响(免疫组化，×400)

表2 大黄泄浊方对CRF大鼠肾组织中GRP78、CHOP蛋白表达的影响

图3 大黄泄浊方对CRF大鼠肾组织中CHOP蛋白表达的影响(免疫组化，×400)

4 讨论

中医学上将CRF归属为“水肿”“腰痛”“肾劳”等范畴。导师檀金川教授认为“虚、浊、瘀、毒”是CRF发生发展过程中的四大主要病机。虚为病之根本，以脾肾两虚为主，是RIF形成的根本。脾肾亏虚，水湿不化积聚日久化热成瘀，湿热瘀蕴结，浊毒内生，湿热、瘀血、浊毒错综交叉为病之关键，是RIF形成的病理学基础。治疗上应当标本兼顾，健脾益肾培其本，针对标实之邪，更应注重清热利湿、化瘀通络、泄浊解毒等治法。大黄泄浊方(由大黄、黄芪、土茯苓、水牛角丝、丹参、当归、醋龟甲、地龙、积雪草组成)是导师檀金川教授根据CRF患者的临床症状特点，以“脾肾两虚、湿热瘀蕴结”的病机要点为依据提出的治疗CRF的常用中药复方，取得较好的临床疗效。方中大黄、黄芪为君药，健脾补肾兼活血化瘀、泄浊解毒，标本兼顾；土茯苓、积雪草清热利湿、泄浊解毒，共为臣药以助君药健脾益肾；丹参活血祛瘀、当归活血且补血，使瘀血得散、活血而不伤正气；醋龟甲滋阴清热、水牛角丝清热凉血；虫类药地龙，善行走窜，通肾络、清除久积之邪。诸药合用，切合“脾肾亏虚、湿热瘀蕴结”的基本病机，具有健脾益肾、清热利湿、化瘀通络、泄浊解毒之功效，适用于CRF早、中期治疗。在本研究中，模型组在造模后出现UTP、血Scr、BUN水平升高，肾脏病理显示肾组织大量胶原纤维沉积提示模型复制成功；给予大黄泄浊方干预后，血Scr、BUN、UTP水平降低，肾脏胶原纤维沉积减少，表明大黄泄浊方具有减缓RIF、降低尿蛋白和改善肾功能进而缓解CRF进展的作用。

研究表明，CRF疾病过程中存在ERS反应的激活，这可能与尿毒症毒素的积聚、微炎症状态及脂类代谢紊乱密切相关[9]。若ERS持续存在，超过未折叠蛋白反应(UPR)能力，激活下游凋亡相关基因，会诱导细胞发生不可逆的凋亡[10]。ERS诱导的细胞凋亡加速了肾脏纤维化进程，抑制ERS表现出显著的肾脏保护作用[11]。GRP78是一种广泛存在于真核生物细胞中ER膜上的分子伴侣热休克蛋白，是UPR跨膜压力的重要传感器[12]。通常GRP78是无活性的，然而ERS发生时，GRP78解离恢复活性优先和错误折叠的蛋白结合以促使恢复正常结构，维持内质网(ER)稳态[12]。本研究中，模型组大鼠GRP78表达量显著增高，提示ERS反应被激活，这与既往研究一致[3, 7]。CHOP在多种功能不同蛋白质的基因表达方面扮有重要角色，是ERS诱导细胞发生不可逆性凋亡的关键调控基因。既往研究显示，沉默CHOP基因降低其表达可有效降低C57BL/6小鼠尿蛋白水平，肾间质炎症和纤维化也随之减轻，证实调控CHOP转录活性在肾脏损害中发挥重要作用[13]。本研究中，模型组大鼠GRP78、CHOP表达量均明显增加，给予大黄泄浊方干预后其含量较模型组均明显减少，表明大黄泄浊方可能通过抑制ERS，减少凋亡，发挥肾脏保护的作用。

综上所述，大黄泄浊方能明显降低血Scr、血BUN水平，降低UTP水平，减缓RIF进程，其机制可能与调控ERS相关蛋白GRP78、CHOP的表达、抑制ERS的激活有关，但其他具体的分子机制有待于进一步探讨。