酸碱指示剂在工业微生物高通量筛选中的应用进展

杨 鑫,赵国淼,朱威宇,丁子元,郑晓卫,杨 凯,孙玉婷

(中粮营养健康研究院有限公司,北京 102209)

酸碱指示剂又称pH指示剂、氢离子浓度指示剂,是于不同pH下显示不同颜色的染料和色素,多为有机弱酸或有机弱碱,达到一定pH时染料和色素会与溶液中的H+或者OH-离子结合,转变为对应的酸式或碱式,进而颜色发生改变。染料和色素的pH变色灵敏度决定了酸碱指示剂的质量。酸碱指示剂按传统分类可分为含硝基的指示剂、酞类指示剂、磺酞类指示剂、甲氧基代三苯基甲醇衍生物、三芳基甲烷衍生物和氮萘系色素等;按结构分类可分为偶氮染料、蒽醌染料、三芳甲烷染料、吖嗪、偶氮苯并噻唑、呫吨类、靛类、酚类、硝基类和噁嗪类;按《染料索引》分类可分为酸性染料、直接染料、媒介染料、碱性染料、溶剂染料、食品染料和天然染料;按显色分类可分为单显色、双显色和双变色[1]。应用酸碱指示剂的微生物筛选方法具有筛选速度快、筛选体系较小的特点,只需在反应过程中产生质子变化。虽然该筛选方法可以提高筛选效率,但是也存在几点不足:灵敏度较差、溶液需澄清、反应中需产生或消耗质子[2]。

高通量筛选技术,即大规模集群式筛选,是一种在新化合物开发及目标菌种选育等方面广泛应用的技术,具有高自动化、高灵敏度和高通量等特点。将直接的颜色反应作为最简便的追踪反应或代谢产物产量的方法被广泛应用于高通量筛选方法的开发,但不是所有的酶、产物都可以直接引起颜色变化,为了检测一个没有生色基团的底物反应,需要将反应产物转变为一个有色化合物,酸碱指示剂通过将检测目标转变成检测质子变化,可在复杂的后续试验中迅速排除不匹配的酶或底物。早在1940年,酸碱指示剂即应用于酶催化反应中释放或消耗质子的检测[3],1970年以来,酸碱指示剂法用来进行酶反应的动力学分析[4]。如今,酸碱指示剂已广泛应用于pH检测[5]、酶活检测、产酸、菌株鉴别、代谢产物产量跟踪和食品质量监测等领域,天然、新型的酸碱指示剂也在逐渐被发现与应用。因此,在工业微生物筛选过程中,酸碱指示剂虽然可以有效区分微生物突变株之间或者酶突变体之间的巨大差异,但不能准确定量检测,且由于其低灵敏度和容易受到微量副产物的干扰,故常用于功能微生物和酶的初级筛选,在牺牲部分准确度的情况下提高筛选通量,以达到高通量筛选的目标。

1 酸碱指示剂的选择

1.1 酸碱指示剂的选择

酸碱指示剂的选择需注意:1) 酸碱指示剂的变色范围与化学计量点吻合或接近;2) 酸碱指示剂的变色范围越窄越好,一般变色范围是1.6～1.8个pH单位;3) 颜色变化明显,便于判断和观察。酸碱指示剂应用中最关键的3个参数是变色范围、λmax(最大吸收波长)和pKa参数(解离常数)值。水溶液中常用酸碱指示剂pKa,λmax和变色范围[6]如表1所示。

表1 水溶液pH指示剂参数表

选择酸碱指示剂时最重要的考虑因素是缓冲体系和酸碱指示剂的电离特性。缓冲液和酸碱指示剂对质子的亲和力必须相同,即pKa值相差<0.1,pH变化时缓冲液质子化和酸碱指示剂质子化的相对数量一致。同时,酸碱指示剂的pKa需与反应体系的pH接近,以使pH的变化带来较大的、线性的颜色变化[7]。Morís-varas等[4]建立了快速筛选水解酶库的方法,该方法适用于大多数脂肪酶、酯酶,磷酸缓冲液pH 7.2与溴麝香草酚蓝、苯酚红的pKa值接近,且颜色转换具有强烈的反差。

1.2 植物基天然色素的选择

植物基天然色素因来源广泛、廉价易得、天然环保,成为替代合成染料的最优选择。天然色素有花青素、姜黄素、紫草素、茜素红和甜菜色素等。天然可食用酸碱指示剂通常是弱有机酸,颜色随周围环境酸碱度的改变而改变。其颜色变化是基于生色团分子水平上的能级跃迁,当聚合物中含有非键电子对的基团时,生色团的吸收峰向长波方向移动并增强吸光度,同时取代基的引入或溶剂改变使聚合物的最大吸收波长和吸收强度发生变化。天然色素通常于酸性条件下颜色较为稳定,于碱性条件下容易发生降解。选择天然酸碱指示剂时,染料需要与分析物发生强烈的反应、与生色团有强烈的颜色反应,且反应前后色差明显,检测结果可靠、可重复[8]。部分天然pH指示剂的变色范围[6]如表2所示。

表2 部分天然酸碱指示剂变色范围

1.3 新型合成酸碱指示剂

相较于传统酸碱指示剂,新型合成酸碱指示剂改进了合成工艺路线,减少了污染,灵敏度和稳定性相应提高。1-8萘二酰亚胺为pH荧光指示剂,可利用分子内部的光诱导电子转移体系,转移体系由包含电子给体的受体部分,通过间隔基S和荧光F相连而构成。荧光团与受体单元之间存在光诱导电子转移,对荧光有非常强的淬灭作用,通常是电子从供体转移到激发态荧光团。在结合客体前,探针分子不发射荧光或荧光很弱;一旦受体与客体结合,光诱导电子转移作用受到抑制,甚至被完全阻断,荧光团就会发射荧光。当环境中不存在H+时1-8萘二酰亚胺无荧光,存在H+时其荧光释放。1-8萘二酰亚胺的最大激发、发射波长分别为405,530 nm,最适浓度为10-5mol/L,且培养基成分对其荧光信号无影响,具有良好的生物相容性[9]。罗丹明B具有水溶性好、量子产率高、消光系数大、低毒和易制备的优势,多用于pH检测,在中性、碱性环境下不产生荧光,在酸性环境下激发荧光。罗丹明酰肼的激发、发射波长分别为563,580 nm,最适浓度为25 μmol/L,李虹庆[10]合成该荧光探针应用于高产聚苹果酸菌株的筛选,于1 000余株突变体库中筛选得到一株产量提升15.3%的突变株。

2 酸碱指示剂在功能菌株筛选中的应用

2.1 酸碱指示剂在平板快速分离筛选中的应用

根据筛选目标选择酸碱指示剂加入固体培养基中,实现目标微生物的快速鉴别,即变色圈法。将待筛选菌悬液涂布于筛选固体培养基上,生长出的单菌落种类、性能不同,肉眼可明显区分开,实现快速分离筛选。培养基中常用的指示剂及变色范围[1]如表3所示。

表3 培养基常用的指示剂及其变色范围

以伊红美蓝乳糖培养基(EMB)为鉴别培养基,可通过肉眼辨别颜色来区分近似菌落。大肠杆菌于EMB培养基上分解乳糖产酸,菌落被染成红色,再与美蓝结合形成紫黑色菌落,并带有绿色金属光泽;产气杆菌则形成呈棕色的大菌落;沙门氏菌等在碱性环境中不分解乳糖,伊红和美蓝不能结合,故其菌落呈无色或琥珀色半透明。结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)常用于肠道菌计数,添加的酸碱指示剂为中性红,其中大肠杆菌、阴沟肠杆菌菌落为紫红色,周围有红色沉淀环;沙门氏菌菌落为无色透明。溴甲酚绿常用于产酸微生物的筛选,其添加质量浓度为0.06 g/L,随着产酸菌株的生长菌落周围形成黄色的变色圈。采用酸碱指示剂平板快速筛选法可实现鉴别微生物、筛选高产菌株的目的,实现定性、半定量筛选。

2.2 酸碱指示剂在高产酶的工业微生物筛选中的应用

菌种是工业发酵生产酶制剂的关键,菌种选育的目标是改良已知菌种或生产菌株,使其符合工业生产要求的产量高、稳定性好的要求。高通量筛选技术可以有效提高高产酶菌株的筛选效率,其中准确、快速的筛选方法是关键。酸碱指示剂常用于酶催化反应中释放或消耗质子的检测。许多水解反应均伴随pH的变化,如氨基酸脱羧酶、碳酸酐酶、胆碱酯酶、己糖激酶、蛋白酶、腈水解酶和酯水解酶等[5],可以根据反应介质和反应平衡常数选择合适的酸碱指示剂以准确地检测水解反应速率。

酯酶(酯水解酶,EC3.1.1.3)是一类既可催化酯键水解,又可催化酯键合成的酶的总称。催化酯键水解时,酯键断裂生成醇和酸。Camacho-Ruiz等[7]应用溴甲酚绿作为酸碱指示剂方便快速地检测短链、中链酯酶活性,pH指示范围为5.0～9.2,检测极限达1 μg游离脂肪酸、1 ng酶。酸碱指示剂为不同生物样品中脂肪酶[11]和脂肪酶抑制剂的高通量筛选提供了有效的筛选工具,亦可用于脂肪酶或酯酶纯化过程中酶活的快速检测。

腈水解酶[12]是一类将腈类化合物直接催化合成相应的羧酸和NH3的可用于生物催化反应的酶类,反应温和高效,不产生酰胺。产腈水解酶的微生物将腈类化合物分解成羧酸,环境的pH发生改变,采用溴百里香酚蓝(pKa=7.3,pH指示范围6.0～7.6,颜色由绿色变化到黄色)作为酸碱指示剂,其配制为m(溴百里香酚蓝)∶V(反应体系)=0.1 g∶100 mL。溴百里香酚蓝的颜色变化肉眼可见,于616 nm波长处具有最大吸收,其吸光度与质子释放呈线性相关性[13]。Banerjee等[14]将该方法用于扁桃腈酶活性筛选,从菌种库中筛选得到7株候选菌株。Kaul等[15]通过该方法,获得3种对苯乙腈具有较高对映选择性的产腈水解酶菌株。因此,酸碱指示剂可简单、快速、直接地指示腈水解酶活性,其操作简单、成本低、耗时短,契合高通量筛选技术的需求。

微生物卤代烷烃脱卤酶是降解卤代脂肪族化合物的关键酶类,催化卤代脂肪族化合物的碳-卤键的断裂,生成对应的醇、卤素离子和一个质子,催化过程中不需要氧气、能量或辅酶/辅基,是一条生物减毒和生物降解的简单路线,具有重要的环境价值和生物技术意义。采用溴麝香草酚蓝作为pH指示剂,浓度为1 mmol/L,于620 nm进行吸光度检测。溴麝香草酚蓝于pH 6.0～7.6时灵敏度较高,其颜色随着酶反应过程中质子的增加由蓝色向黄色转变。酸碱指示剂法用于筛选卤代烷烃脱卤酶提高了突变库的筛选通量,通过检测质子释放速率,确定酶活性高的突变株。Zhao[16]应用易错PCR进行迭代突变,获得一株于53 ℃下热钝化半衰期延长140倍的突变株,比酶活较原始酶提高10倍。

黑曲霉产酶过程中会带来发酵液pH的变化,且呈现负相关性,因此,可将酸碱指示剂信号表征转换成酶活信号,实现酶活的高通量、快速、准确和实时的监测。朱旭东[9]在黑曲霉发酵产糖化酶过程中,发现酶活性与pH存在极好的负相关关系,且重复性好,作者使用甲基橙作为酸碱指示剂。甲基橙的最大吸收波长为507 nm,随着pH的升高,颜色由红色逐渐变黄,甲基橙的配制为m(甲基橙)∶V(水)=0.1 g∶100 mL,检测体系中甲基橙添加体积分数为10%,反应时间为10 min。应用该方法于1 200余株黑曲霉突变株中筛选得到酶活性提高70%的突变株。

酸碱指示剂虽然在产酶[17]工业微生物筛选中的应用具有适用范围广、操作简单、成本低和耗时短等优势,但在微生物全细胞快速筛选过程中,菌体的存在或者某种络合物的存在会对吸收值产生干扰,且部分酸碱指示剂的溶解性较差,需要选择合适的共溶剂或乳化剂处理才能进行检测。

2.3 酸碱指示剂在工业微生物产酸性能筛选中的应用

微生物代谢过程中合成有机酸[18-19]会导致发酵液pH的变化,随着产酸量的提高,pH逐渐降低,酸碱指示剂颜色逐渐变化,肉眼可实时观察,操作简单、快速和高效。涂光伟等[20]应用酸碱指示剂筛选高产聚苹果酸菌株,利用聚苹果酸分子结构中的弱酸基团(—COOH),溴甲酚绿作为指示剂,通过发酵液的颜色变化来指示产酸能力。出芽短梗霉产生的有机酸主要是聚苹果酸,其次是乳酸、乙酸和琥珀酸等杂酸,且总杂酸质量分数较低。涂光伟等[20]首先建立了发酵液pH与氢离子浓度的响应模型,然后通过遗传算法迭代处理,建立非线性拟合发酵液中聚苹果酸质量浓度与环境pH的响应模型。笔者应用该筛选模型筛选得到一株聚苹果酸产量提高24.5%的突变株。马武[21]于1985年将酸碱指示剂用于谷氨酸生产菌的复壮分纯,培养基中添加体积分数为5%的酚红溶液(质量分数0.1%),通过指示剂颜色的变化来控制流加尿素量。该方法大大简化了pH检测流程,提高了试验平行性,酸碱指示剂对发酵产酸无影响。Lü等[22]将溴甲酚绿用于高产乳酸凝结芽孢杆菌的初级筛选,高效液相色谱、气相色谱和生物传感器等方法都严重限制了筛选通量。添加的溴甲酚绿的质量浓度为0.06 g/L,最大吸收波长为616 nm,乳酸浓度从0 mol/L增加到1.2 mol/L,溶液的颜色由蓝色变为黄色。

3 结 论

以应用酸碱指示剂为代表的高通量筛选方法,是当前工业微生物筛选酶、代谢产物的主要研究和发展方向。酸碱指示剂种类多,可覆盖整个pH范围,具有特征吸收波长,在指示范围内,吸光度与pH具有良好的线性关系,可广泛应用于有质子吸收或释放的反应体系。酿酒过程中有强大、复杂的微生物体系,不同的功能微生物具备不同的酶活性,它们相互协作并代谢产生多种功能成分,酸碱指示剂高通量筛选方法可有效应用于酿造过程中功能微生物的筛选,提高筛选效率,简化筛选难度。筛选过程中可结合平板初筛、液体培养酸碱指示剂显色定量复筛和摇瓶验证的筛选路线,实现微生物高通量乃至超高通量筛选。中粮营养健康研究院有限公司高通量筛选平台已建立覆盖pH为3～11的酸碱指示剂筛选方法,应用于多种酶活性、有机酸功能菌株的筛选。为了使酸碱指示剂法在高通量筛选技术中应用更广泛,还需进一步研究酸碱指示剂在不同酶活性检测、代谢产物检测等方面的适配性与专一性,降低干扰物质对其准确性的影响,提高筛选准确度。