CAR-T细胞治疗实体瘤的脱靶效应及优化方略①

彭灿灿 王惠明

（武汉大学人民医院肾内科，武汉430060）

2017年以来，美国食品药品监督管理局接连批准诺华公司的嵌合抗原受体T 细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）细胞产品CTL019 和Kite 制药的Yescarta（KTEC19）上市，CAR-T 疗法开始出现在大众视野，并逐渐成为最具前景的肿瘤治疗方式之一。近年CART在血液系统肿瘤治疗，尤其是靶向CD19 CAR-T在急性难治型淋巴细胞白血病治疗中，取得了瞩目成就［1］。但CAR-T 在实体肿瘤方面却鲜有实质进展，可能与脱靶效应、归巢及T 细胞耗竭等有关。本文结合近年实体瘤相关研究，就CAR-T 细胞治疗实体瘤脱靶效应进行综述，并提出优化方略。

1 脱靶效应概念及产生原因

肿瘤抗原根据其特异性可分为：肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigen，TSA）和肿瘤相关性抗原（tumor-associated antigen，TAA）。肿瘤表面肿瘤特异性抗原较为缺乏，CAR-T 靶向的多为肿瘤相关性抗原，因此，CAR-T 在识别杀伤肿瘤细胞同时，损伤低表达靶抗原的正常组织，产生脱靶效应，严重可危及患者生命。2010年，MORGAN 等［2］设计靶向ERBB2 CAR-T 治疗结肠癌患者，患者于输注CAR-T 5 d后出现进行性低血压和心动过缓，随后死于心脏骤停，为CAR-T识别并攻击低表达ERBB2的肺上皮细胞所致。因此，脱靶效应在CAR-T 细胞治疗实体瘤中备受关注。

2 克服CAR-T 细胞治疗实体瘤脱靶效应的研究进展

2.1 寻找合适的肿瘤相关性抗原 目前发现的肿瘤特异性抗原较少，EGFRvⅢ（EGFR 受体突变体）作为少有的肿瘤特异性抗原，可被CAR 精准识别，在胶质母细胞瘤治疗中显示出较好疗效［3］。而肿瘤相关性抗原则较多，间皮素（mesothelin，MSLN）可用于恶性间皮瘤、胰腺癌等治疗，神经节苷脂2（GD2）可用于神经母细胞瘤等治疗，人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）可用于乳腺癌治疗等，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）可用于胃肠道肿瘤和部分腺癌治疗，前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）可用于前列腺癌治疗等。实体肿瘤具有高度异质性，即使在同一肿瘤病灶内，单一肿瘤相关性抗原也无法覆盖所有肿瘤细胞，另外肿瘤相关性抗原在正常组织表达引起CAR 识别杀伤可能导致灾难性脱靶毒性，因此，选择合适的肿瘤相关性抗原至关重要［4］。理想的肿瘤相关性抗原应100% 表达于肿瘤细胞，同时应保证在正常组织上不表达或低表达，若低表达于心脏、肝脏、肺脏等重要器官可能引发严重后果［5-6］。寻找合适的肿瘤相关性抗原需要在CAR 杀伤肿瘤细胞效力和对低表达靶抗原的正常组织导致脱靶毒性间获得最好的平衡，力求对重要脏器损伤达到最小且不影响靶向杀伤肿瘤细胞。

2.2 靶向肿瘤特异性糖基化位点 CAR-T 多数靶向肿瘤相关性抗原，肿瘤细胞和正常组织均有表达，不可避免出现脱靶毒性，除少有的特异性抗原EGFRvⅢ（EGFR 受体突变体）外，肿瘤特异性的糖基化靶点也是免疫治疗的理想靶点。

黏蛋白1（Mucin1，MUC1）是一种大分子跨膜糖蛋白，在多种腺癌中高表达，包括胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌等恶性肿瘤，且相对于正常细胞，肿瘤细胞表面MUC1 错误表达为糖基化异常。以MUC1 为靶点，构建靶向MUC1 的CAR-T 细胞，体外实验中分别检测对肝癌细胞和正常组织的靶向杀伤作用，结果发现靶向MUC1 的Jurkat CAR-T 细胞可特异性杀伤MUC1 高表达肝癌细胞，为靶向肿瘤特异性糖基化位点MUC1 的CAR 修饰患者原代T 细胞用于肝癌临床治疗提供可靠依据［7］。POSEY等［8］发现，T 细胞白血病和胰腺癌异种移植模型中，抗Tn-MUC1 CAR-T 细胞具有靶向细胞毒性，并成功控制肿瘤生长，证明了靶向Tn-MUC1的CAR-T 治疗效果，并提出了异常糖基化抗原可作为工程化T 细胞治疗肿瘤的新靶点。

2.3 “逻辑门”设计

2.3.1 双特异性CAR CAR-T 疗法在临床应用应严格确保其安全性，仅高于正常组织表达的单一靶抗原显然无法满足其安全性要求，因此另一种解决脱靶效应的方法应运而生。

将靶向2种不同抗原的scFv分别与激活信号和共刺激信号连接，识别第一抗原的scFv 与激活信号相连，识别第二抗原的scFv 与共刺激信号相连，CAR-T 细胞仅能靶向识别同时表达这2 种抗原的组织或细胞（图1），增强其特异性，从而避免脱靶效应［9］。 WILKIE 等［10］设计出 靶向 乳腺癌2 种 抗原ErbB2 和MUC1 的双特异性CAR-T 细胞，结果发现，靶细胞共表达ErbB2 和MUC1 下T 细胞才能有效杀伤肿瘤细胞并扩增，且对仅表达单一抗原的细胞无影响。动物实验中有用于T 细胞活化识别的第一抗原Meso，也有用于T 细胞共刺激识别的第二抗原FRa［11］。

图1 双特异性CAR作用机制模型［9］Fig.1 Model of bi-specific CAR action mechanism［9］

2.3.2 iCAR 免疫检测点如程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）、细胞毒T 淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）、B 和T 细胞衰减器（B and T cell attenuator，BTLA）等分子在正常情况下可竞争性抑制T 细胞活化及其他功能，同时在肿瘤组织中可能被用于诱导免疫逃逸，近年受到广泛关注［12-13］。

CAR-T 细胞对靶抗原表达的肿瘤组织和正常组织均有杀伤作用，一种可供选择的解决方法是应用iCAR［9］。iCAR 是在原有CAR 基础上合成的抑制性CAR，不同于双特异性CAR，合成的抑制性CAR识别肿瘤细胞表面TAA 的同时，其表面抑制性受体可识别存在于正常细胞而肿瘤细胞中不存在的抗原（图2），既保证对肿瘤的正常靶向杀伤作用，也保护正常细胞免受CAR-T 细胞靶向损伤，FEDOROV等［14］通过构建胞内域抑制性分子PD-1 或CTLA4 受体的iCAR验证此方法可控制CAR-T活化及应答。

图2 iCAR作用机制模型［14］Fig.2 Model of iCAR action mechanism［14］

2.3.3 SynNotch 受体 另一种有效增强治疗性T 细胞靶向性的方法是合成Notch 受体（SynNotch 受体），ROYBAL 等［15］构建1 个组合激活的T 细胞回路，其中识别1个TAA 的合成Notch 受体诱导第2个TAA 的CAR 表达，这些双受体“AND”逻辑门控T 细胞仅在双抗原肿瘤细胞存在下才被激活（图3）。Notch 信号通路是癌症中最常激活的信号通路，是癌症治疗与研究的新靶点［16-17］。

图3 SynNotch受体作用机制模型［15］Fig.3 Mechanism model of SynNotch receptor［15］

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1）同质性表达于卵巢癌、乳腺癌、肺腺癌，在一些正常组织如甲状旁腺、胰岛、食管部分区域、胃和十二指肠也有表达［18］。SRIVASTAVA 等［19］设计靶向ROR1 的CAR-T细胞表达针对肿瘤抗原EpCAM 或B7-H3 的Syn-Notch 受体，该抗原表达于肿瘤细胞而非基质细胞，结果表明B7-H3 更适合于临床SynNotch 靶点应用，逻辑门控应用为CAR-T 细胞治疗实体瘤拓宽了道路。

2.4 导入自杀基因 目前基因治疗中常用的自杀基因包括单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK）基因、诱导凋亡相关基因caspase-9（iCasp9）和EGFRt 基因。 iCasp9 和EGFRt 基因是人源性蛋白，二者免疫原性较低，而HSV-TK 免疫原性较高。HSV-TK 可磷酸化特定核苷类似物，如鸟嘌呤核苷类似物更昔洛韦（GCV），形成三磷酸产物并结合至DNA，导致抑制DNA合成并导致分裂的细胞死亡（图4A）［20］。HSV-TK多用于控制移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD），疗效较好，但其缺陷性在于HSV-TK免疫原性导致正常免疫系统消除转导T 细胞，以及临床上出现与使用前药GCV 进行治疗不相容现象，导致转导T 细胞不必要消除［21-22］。iCasp9 系统包括iCasp9基因和化学诱导二聚反应（CID）药物。iCasp9 基因与来自人FK506 结合蛋白的药物结合域融合，AP1903可使该融合蛋白药物结合区交联，激活下游caspase-3 分子，导致细胞凋亡（图4B）［23］。WITTE等［24］将iCasp9M 安全开关用于诱导糖尿病小鼠细胞治疗发现，由于iCasp9 系统可直接激活效应者半胱天冬酶如caspase-3，7，9，相较于其他系统，iCasp9系统可更为快速地消除T 细胞，因此这个开关的触发可有效阻止正在进行的、有致命风险的自身免疫攻击。 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）广泛分布于人体细胞表面，WANG等［25］通过逆转录病毒将人EGFR 多肽转染至CAR-T细胞膜，当发生不良反应时，采用西妥昔单抗可消除转染的CAR-T细胞（图4C）。相对于基于CD20表达及利妥昔单抗应用的方法，此法不会引起正常B细胞消除。

图4 3种自杀基因作用机制模型［16］Fig.4 Three models of action mechanism of suicide genes［16］

2.5 肿瘤细胞内抗原外表达 寻找新型肿瘤特异性抗原对于CAR-T 细胞成功治疗实体肿瘤至关重要，肿瘤特异性抗原分布于细胞表面或细胞内，有研究提出，既然肿瘤细胞表面特异性抗原较为缺乏，可转向应用肿瘤细胞内特异性抗原，且多种肿瘤细胞内的抗原属于肿瘤特异性抗原。

细胞内抗原加工提呈给免疫系统主要通过MHCⅠ类途径，又称胞质溶胶途径：细胞中产生的内源性抗原在蛋白酶体及其他蛋白水解酶下降解，产生适合与MHCⅠ类分子结合的短肽，抗原加工相关转运蛋白（transporter associated with antigen processing，TAP）将内源性Ag 肽从蛋白酶体转运至内质网（ER），钙网蛋白参与下内质网中的MHCⅠ类分子荷肽转运至细胞表面，被CD8+Tc 识别杀伤（图5）［26-28］。荷肽复合物（peptide-loading complex，PLC）包括TAP、TAP 相关蛋白、MHCⅠ、ERp57 和钙网蛋白，PLC 确保MHCⅠ类分子负荷有效的抗原肽，另外内质网氨肽酶相关处理（ER aminopeptidase associated with antigen processing，ERAAP）可能也参与多肽加工处理使其适于MHCⅠ类分子负荷，而这些因子在细胞暴露于IFN-γ时表达上调［29］。

图5 基本的MHCⅠ类抗原呈递途径［26］Fig.5 Basic MHCⅠantigen presentation pathways［26］

GERBER 等［30］也提出胞内靶抗原表达的金标准尚不统一，HLA 提呈胞内抗原表位密度远低于细胞表面抗原密度以及需要一系列加工才能与HLA复合物结合等问题为未来选择性肿瘤特异性、胞内靶抗原应用提供了方向。

2.6 单克隆抗体封闭靶抗原 向患者输注提前设计好的CAR-T 细胞前，采用针对该TAA 的单克隆抗体预先封闭正常组织低表达靶抗原，可有效减少后续治疗中可能出现的脱靶效应。LAMERS等［31］设计靶向CAIX 的CAR-T 细胞治疗转移性肾细胞癌患者，将接受CAT-T 细胞治疗的患者分为3组，为管理患者脱靶毒性，输注CAR-T 细胞前3 d 向其中一组的4 位患者静脉注射抗CAIX 单克隆抗体G250，随后输注CAR-T 细胞，立即监测肝脏活性，该组患者并未观察到肝脏毒性，但该方法能否用于其他CAIX靶向正常组织导致的脱靶毒性仍需进一步研究。

2.7 亲和力转变 当二价配体的2 个药效团同时结合至其靶位时，其表现出显著亲和力和靶停留时间增加，由于1 个药效团结合迫使第2 个保留的药效团靠近其相应位置；此外，这种“强制接近”产生局部高浓度的游离药物团也将显著增加其再次与原靶点结合的机会，引发“重新绑定”［32］。采用二价配体结合特性可帮助优化肿瘤抗原靶向性，同时保留低靶向性的正常组织。

CD38 在所有多发性骨髓瘤（MM）细胞呈高表达，但在一些造血细胞上呈中等水平表达，包括自然杀伤细胞、单核细胞和小部分T 细胞。DRENT等［33］提出一种新的可行的技术产生一群具有不同亲和力的抗体，通过系统分析筛选出合适的单链抗体使CARs 可有效靶向肿瘤，而脱靶效应较小或没有，证明单链抗体可选择性靶向TAA，如MM 的CD38，且对靶抗原具有最佳亲和力。

2.8 其他 改变T细胞输注途径，如胸膜内注射靶向间皮素的CAR-T 细胞治疗恶性胸膜肿瘤，颅内注射治疗多形性胶质母细胞瘤，瘤内注射使多数CART 细胞聚集于病灶范围内，强化治疗效果，同时限制其对正常组织的靶向毒性［34-35］；mRNA 电穿孔技术用于CAR-T 细胞基因转导，CAR 瞬时表达，可较好调控治疗过程中的不良反应［36］；控制CAR-T 细胞输注剂量，通常CAR-T 细胞剂量与毒性呈正相关，应谨慎选择首次治疗的CAR-T 细胞剂量，临床治疗中可平稳提高输注剂量；通过感知肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），如缺氧和酸性环境等，使CAR-T 细胞仅能在肿瘤位点激活，进而杀伤肿瘤细胞，提高CAR-T 安全性；脱靶毒性往往与各种细胞因子释放密切相关，临床上避免脱靶效应产生的同时也需要重视对细胞因子释放综合征的治疗。

3 结语

近年CAR-T 疗法在血液系统治疗中取得了良好疗效，研究者坚信其在实体瘤治疗中同样具有巨大潜力。实体肿瘤高异质性及肿瘤特异性抗原缺乏导致CAR-T 细胞治疗实体瘤中出现的脱靶效应是其应用中的较大障碍。避免脱靶效应产生有2个思路：一是增强CAR-T 对肿瘤细胞的靶向性；二是抑制CAR-T 靶向杀伤正常细胞。目前提出的针对脱靶效应的优化策略多基于动物实验，很难在人体中完全再现，从临床前试验到临床应用过程漫长而艰辛。虽然这些策略可能存在不足，需要改进或优化，但课题组相信随着免疫学技术不断发展，下一代CAR-T 细胞可表现出更优越的安全性和有效性，脱靶效应及其他毒副反应发生率将不断降低，必将给实体肿瘤患者带来希望。