牛磺酸对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用机制

刘 锐，林秀玉，孙兆瑞，聂时南

0 引 言

脓毒症的发病通常是由严重感染引起的，其特征是压倒性的全身炎症，临床上常见脓毒症能够导致急性肺损伤，并且是导致重症患者死亡的主要原因之一[1-2]。脓毒症导致的急性肺损伤晚期可发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，病死率高达30%～40%，因此预防与早期治疗十分必要[3-4]。ALI的发病机制比较复杂，有研究认为机体内氧化与抗氧化平衡失调引起肺组织强烈的氧化应激和炎症反应在ALI病程中起着重要的作用[5]。研究报道核因子-κB(nuclear factor -kappa B, NF-κB)信号通路的激活在ALI 的发生、发展中也起着重要的调控作用，其能够调控炎症因子的产生和释放[6]。如能有效地控制肺损伤发生时肺组织内炎症因子的生成及抑制过度的氧化应激反应, 对脓毒症引起的ALI 的治疗具有重要意义。相关研究表明牛磺酸(Taurine)，一种机体内广泛存在的游离氨基酸，其具有抗氧化、解毒、渗透调节、抗炎、调节细胞内钙稳态及膜稳定作用[7-8]。既往研究证实牛磺酸能够调节氧化应激反应，抑制细胞凋亡，减少免疫炎性因子的表达，减轻细胞损伤和肺损伤[9-10]。然而牛磺酸对脓毒症引起的ALI 的影响的研究报道较少，为此本研究探讨牛磺酸在脓毒症大鼠急性肺损伤中的作用及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料牛磺酸购自美国Sigma公司，p-p65和β-actin抗体购自英国Abcam公司)，髓过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛检测试剂盒均购自南京建成生物公司，i-STAT便携式临床分析仪及血气分析试剂盒购自美国Abbott 公司，酶联免疫吸附反应试剂盒购自上海基远生物科技有限公司。

1.2实验动物分组健康清洁级SD大鼠48只，体重180～220 g，由东部战区总医院比较医学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(军)2017-0036。按标准饮食在屏障环境中喂养，每日光照和黑暗各12 h。随机数字表法分为3组：对照组，急性肺损伤组(ALI组)，牛磺酸治疗组(ALI+Taurine组)。盲肠结扎穿孔法建立脓毒症大鼠ALI模型，方法简述如下：4%水合氯醛1 mL /100 g 腹腔注射麻醉，固定、备皮，碘酒消毒，铺无菌洞巾。腹部正中切开1.5 cm，找到回肠末端，轻轻翻出盲肠，避免损伤肠系膜血管，轻轻挤压盲肠上段粪便，使盲肠末端充盈。无菌4号线在盲瓣与盲肠中点进行结扎，避免伤及回肠及盲肠系膜血管，用无菌18#针头在结扎处与盲肠顶端中点处贯通穿刺盲肠壁，造成穿孔，挤出少量肠内容物以保证穿孔的通畅性，将挤出的内容物擦净。随后，按生理位置将盲肠还纳腹腔，逐层缝合关闭腹腔。术后立刻皮下注射等渗盐水2 mL /100g 进行液体复苏。随即放回鼠笼，室温，自由饮水、进食。对照组只开腹不手术， ALI + Taurine组于术后6 h腹腔注射牛磺酸200 mg/kg，连续2 d，对照组和ALI组腹腔注射等量等渗盐水5 mL /kg。各组于术后3 d麻醉处死大鼠，留取肺组织和血液标本，进行相关后续实验。

1.3肺组织HE染色各组大鼠肺组织剪取右下肺叶，4%多聚甲醛固定16 h，经梯度脱水，石蜡包埋，做成4 μm厚度的切片，按照操作说明，切片进行HE染色，在100 倍光镜下观察肺组织结构改变情况，并进行病理评分。

1.4血气分析使用i-STAT©G7+试剂盒和i-STAT便携式临床分析仪对大鼠动脉血氧分压和二氧化碳分压进行分析，以明确肺呼吸功能的变化情况。处死大鼠之前，从大鼠左心室抽取动脉血，加入标本孔中，体积80～100 μL。然后进行分析计算，记录PaO2和PaCO2值。

1.5肺组织湿干重比测定各组实验大鼠处死后，迅速摘取部分左肺下叶，用磷酸盐缓冲液洗去残血，滤纸吸干，分析天平称重后，置于65 ℃烘箱烘干，直至肺组织重量不再变化，分析天平称重并记录数值，对湿干重比进行测算。

1.6肺组织MDA含量和MPO、SOD活性的测定各组实验大鼠处死后，迅速摘取部分右肺下叶，用磷酸盐缓冲液洗去残血，滤纸吸干，分析天平称重后，于4 ℃条件下用电动匀浆器制成10%(W/V)的组织匀浆。在4 ℃下将其以1500×g离心10 min，吸取上清液，分装后于-80 ℃保存用于检测肺组织MDA含量和MPO、SOD活性。取各组肺组织匀浆上清液分别按试剂盒说明书的操作进行测定。通过测定吸光度值( 最大吸收峰分别为460 、550 和532 nm) 计算出各组肺组织样本中MPO、SOD活性和MDA 含量，单位分别为U/g 、U/mg 和nmol/mg。

1.7ELSIA测定肺组织内炎症因子IL-1β and TNF-α的表达量取各组肺组织匀浆上清液按ELSIA试剂盒说明书的操作进行测定肺组织内炎症因子IL-1β and TNF-α的表达量，单位为pg/mg。

1.8Western blot技术检测NF-κB信号通路关键蛋白p-65蛋白的表达情况剪取各组大鼠部分左下肺叶，加入组织RIPA裂解液，研磨匀浆后，离心提取上清，Bradford检测蛋白浓度，加入loading buffer溶液，存于-80 ℃，用于后续Western Blot实验。

Western Blot过程：每个样本取等量蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳, 电压l00 V，100 min，电泳后，进行转膜，电压20 V，时间10 min。转膜后， PBS漂洗3×5 min。取出膜，放于封闭液(含3% 脱脂奶粉和0.3% BSA)中，37 ℃封闭2 h。PBST(含0.05%Tween 20的PBS)漂洗1次，每次5 min，将膜按照分子量裁成小条，加入单克隆兔抗p-p65和β-actin抗体(1∶3000)，4 ℃孵育过夜后用适量PBST漂洗6×5 min。将膜又分别浸入1∶10 000的带HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h后用适量PBST漂洗6×5 min。ECL显色。FluorChem FC2成像系统采集图像。

2 结 果

2.1 牛磺酸减轻脓毒症大鼠急性肺损伤并改善肺功能肺组织HE染色后，光镜下观察并拍照，检测发现对照组，肺组织未见异常，肺泡组织结构清晰。与对照组相比，ALI组大鼠肺组织可见肺间质水肿，肺泡结构出现紊乱，肺泡腔有大量炎性细胞浸润，肺泡间隔增宽；肺组织损伤病理评分上升，肺湿干重比显著上升(P<0.05)，PaO2数值显著下降而PaCO2数值显著上升(P<0.05)。与ALI组相比，ALI + Taurine组肺组织病变明显轻于ALI组，肺泡结构有所修复，肺泡完整；而肺组织损伤病理评分显著下降，肺湿干重比显著下降(P<0.05)，PaO2数值显著上升而PaCO2数值显著下降(P<0.05)。见图1，表1。

a:对照组; b:ALI组; c:ALI + Taurine组图 1 各组大鼠肺组织病理观察(HE ×100)Figure 1 Observationand detection of pathology of lung tissue in each group (HE ×100)

表 1 各组大鼠肺组织病理损伤指标检测Table 1 Detection of the pathological injury indexes of lung tissue in each group

2.2牛磺酸抑制脓毒症大鼠肺组织内氧化应激反应ALI大鼠肺组织内MPO活性和MDA含量显著高于对照组，而SOD活性显著低于对照组(P<0.05)，这表明脓毒症导致急性肺损伤后，引起肺组织内氧化应激水平升高。而给予脓毒症模型大鼠Taurine后，与ALI组大鼠相比，Taurine能够显著降低肺组织内MPO活性和MDA含量，提高SOD活性(P<0.05)，结果表明，Taurine抑制了脓毒症肺损伤大鼠肺组织内的氧化应激反应。见图2。

a:MPO活性检测；b:MDA含量检测；c:SOD活性检测与对照组比较，*P<0.05 ；与ALI组比较，#P<0.05图 2 MPO、MDA、SOD检测试剂盒分别检测各组大鼠肺组织内MPO和SOD活性及MDA含量Figure 2 MPO activity, MDA expression and SOD activity were detected by detection kitrespectively

2.3牛磺酸抑制脓毒症大鼠肺组织内炎症反应并降低IL-1β和TNF-α的表达水平结果发现ALI大鼠肺组织内IL-1β和TNF-α的表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而给予Taurine处理后，与ALI组大鼠相比，Taurine能够显著降低肺组织内IL-1β和TNF-α的表达水平(P<0.05)，结果表明，Taurine抑制了脓毒症肺损伤大鼠肺组织内的炎症反应水平。见图3。

1：对照组； 2：ALI组； 3：ALI+Taurine组a:IL-1β的表达水平；b:TNF-α的表达水平与对照组比较，*P<0.05 ；与ALI组比较，#P<0.05图 3 ELSIA检测各组大鼠肺组织内IL-1β和TNF-α的表达水平Figure 3 ELSIA was used to detect the expression of IL-1β and TNF-α in lung tissue of each group

2.4牛磺酸对NF-κB信号通路关键蛋白p-p65表达水平的影响检测结果发现脓毒症导致大鼠急性肺损伤后，ALI组大鼠肺组织内p-p65的表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而给予Taurine处理后，与ALI组大鼠相比，Taurine能够显著抑制p-p65的表达水平(P<0.05)。结果表明，Taurine抑制了脓毒症诱导的ALI大鼠肺组织内NF-κB信号通路的激活。见图4。

1：对照组； 2：ALI组； 3：ALI+Taurine组a:Western blot 检测；b:各条带灰度值分与对照组比较，*P<0.05 ；与ALI组比较，#P<0.05图 4 蛋白免疫印迹检测大鼠肺组织中NF-κB信号通路关键蛋白p-p65表达水平Figure 4 Western blot was used to detect the expression level ofp-p65 of NF-κB signaling pathway

3 讨 论

脓毒症是临床急危重症患者的常见的严重并发症之一，常由严重感染、休克、创伤及烧伤等因素所引起，严重者可导致脓毒性休克及多器官功能障碍综合征(MODS)。脓毒症患者病情发展极为迅速，是导致急危重症患者预后不良的重要因素，其发病率高，病死率高达30%～40%，严重威胁重症患者的生命并影响其生存质量，是全球医学界面临的重点难题[11-12]。脓毒症时，可导致微循环障碍、组织缺氧、肺部炎症和通透性增加等病理过程，多种炎症细胞、免疫细胞等聚集肺部，释放炎性细胞因子、过氧化物、白三烯等大量促炎介质和氧化应激产物，能够引起肺上皮和内皮组织损伤、细胞凋亡，引起肺泡结构紊乱[13]。本研究通过盲肠结扎穿孔实验成功建立了脓毒症急性肺损伤大鼠模型，通过相应实验手段观察并检测了相关指标的变化情况，发现脓毒症导致ALI发生后，大鼠肺组织水肿，大量炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱并增厚，肺损伤病理评分明显上升，肺呼吸功能减弱，肺湿干重比增加，表明脓毒症导致了严重的肺损伤。本研究探讨了牛磺酸对脓毒症大鼠ALI的保护作用，通过实验发现牛磺酸干预后能够显著减轻肺损伤，抑制肺损伤的发生发展，促进肺组织修复和肺功能恢复，肺损伤评分和肺湿干重比明显低于ALI组，证实牛磺酸能够改善肺水肿程度，对ALI具有一定的治疗作用。

脓毒症ALI的病理生理过程十分复杂，研究认为氧化应激反应是ALI发生发展的重要因素之一[14-15]。ALI发生时，中性粒细胞在肺组织内大量聚集，产生过量的氧自由基，导致机体氧化/抗氧化机制失衡，从而参与了肺损伤的发生发展[16]。MPO活性、MDA含量和SOD活性作为反映氧化应激状况的指标，往往用于检测组织或器官损伤时氧化应激反应程度。本研究结果显示，脓毒症导致ALI发生后，肺组织内MPO活性、MDA含量显著升高，而SOD活性显著下降，证实ALI 发生时过量氧自由基可引发肺组织明显的脂质过氧化反应，而SOD 作为清除氧自由基的重要抗氧化酶则不断被消耗和破坏，导致氧化/抗氧化失衡，从而最终引起ALI肺组织内氧化应激程度升高。而牛磺酸干预能够显著抑制MPO活性，减少MDA含量，促进SOD活性上升，证实牛磺酸具有抗氧化能力，可清除肺组织中大量的氧自由基，同时具有调节抗氧化酶活性的能力，在一定程度上减轻了肺组织内的氧化应激反应。

既往研究认为机体失控性炎症反应是脓毒症发病机制的重要基础，ALI早期释放的细胞因子分为促炎和抗炎细胞因子两大类，而促炎与抗炎作用的失衡将会启动后续的炎症级联反应，从而促进ALI的发生发展[17]。其中TNF-α和IL-1β是ALI炎症早期最主要的促炎细胞因子，在免疫反应中起着重要的调控作用，TNF-α与IL-1β 共同启动后续炎症反应。本研究发现脓毒症ALI发生后，ALI大鼠肺组织内炎性因子TNF-α和IL-1β的表达水平显著升高，而牛磺酸干预能够显著抑制TNF-α和IL-1β的表达，表明牛磺酸具有显著的抗炎能力。核因子-κB(Nuclear factor kappa B, NF-κB)信号通路与炎症介质的产生和免疫反应密切相关，NF-κB的激活能够促进大量促炎因子的合成与释放，从而引起炎症级联反应，参与ALI的发生发展[18-19]。本研究通过检测NF-κB信号通路中关键蛋白p-p65的表达水平，证实脓毒症ALI发生后，p-p65表达水平显著升高，表明NF-κB信号通路显著激活，而牛磺酸干预能够抑制p-p65的表达水平，证实牛磺酸能够通过阻断NF-κB信号通路抑制炎症反应，减少促炎因子的产生和释放，发挥对脓毒症急性肺损伤的保护作用。

综上所述，牛磺酸对脓毒症导致的大鼠急性肺损伤具有一定的保护作用，能够减轻大鼠肺损伤，改善呼吸功能，促进肺组织修复，其可能的作用机制是通过抑制氧化应激反应和炎症反应，并抑制炎症反应相关的NF-κB信号通路。然而牛磺酸对NF-κB信号通路调控的详细机制及其对炎症因子表达水平的调控机制尚未阐述清楚，牛磺酸在抗氧化中的具体机制等问题尚不完全清楚，有待今后从分子水平进一步探讨阐明具体作用机制。