电针与经颅磁成对关联刺激对大脑运动皮层兴奋性的作用

萧嘉欣,黄键澎,刘健华

（1.广州中医药大学,广州 510000;2.广州中医药大学第二临床医学院,广州 510405）

脑可塑是指大脑具有在外界环境和经验的作用下塑造大脑结构和功能的能力。脑的结构可塑是指大脑内部的突触、神经元的连接可以由于学习和经验的影响建立新的连接,从而影响个体的行为。功能可塑性可以理解为通过学习和训练,大脑某一代表区的功能可以由邻近的脑区代替,或脑损伤患者在经过学习、训练后脑功能在一定程度上的恢复。

Stefan K等[1]于 2000年首次提出成对关联刺激（paired associative stimulation, PAS）的概念,即一个经颅磁刺激（transcranial magnetic stimulation, TMS）配对一个外周神经传入的电刺激,通过特定的刺激间隔,诱导大脑运动皮层长时程增强（long-term potentiation, LTP）和长时程抑制（long-term depression, LTD）效应。由于PAS可以通过长时程增强和长时程抑制效应引起皮层的可塑性变化,PAS是皮层可塑性机制研究中的一个重要方面,已成为一种常用的检测和评估方法,广泛应用于运动皮层可塑性的研究中。

近年来,PAS逐渐作为治疗手段被应用于临床。已有临床研究表明,PAS能促进卒中患者运动功能恢复[2-3]。另外,一些研究发现,PAS对大脑运动皮层兴奋性的调节作用优于重复经颅磁刺激（repeated transcranial magnetic stimulation, rTMS）[4],且PAS无rTMS诱发癫痫的风险。

针灸被广泛应用于神经系统损伤后的康复,且前期研究亦表明,生理及病理状况下电针可调节大脑运动皮层兴奋性[5-8]。因此,本研究旨在比较电刺激先于磁刺激25 ms的电针与TMS成对关联刺激模式（paired associative electroacupuncture and transcranial magnetic stimulation, PAET）与传统 PAS模式对脑可塑性（LTP效应）的影响,探讨PAET25能否作为一种有效的新型康复治疗手段。

1 临床资料

1.1 一般资料

研究对象为2020年10月至2021年2月来自广州各大高校的 15例青年健康志愿者,其中女 7例,男8例;年龄 18～27岁,平均（21±3）岁。研究过程中无志愿者退出、脱落,最终有15例志愿者纳入研究分析。本研究已于2020年10月通过广东省中医院伦理委员会审批（广东省中医院伦理委员会BF2020-187-01）。

1.2 纳入标准

①既往体健;②右利手;③年龄18～30岁,不限性别;④近3个月未接受中枢刺激（rTMS、TDCS等）或外周刺激（针灸、经皮神经电刺激等）;⑤签署知情同意书,自愿参加本研究。

1.3 排除标准

①有高血压、糖尿病及严重的心、肝、肾等脏器疾病病史者;②有颅脑外伤史或颅脑手术史者;③有癫痫、痴呆、精神分裂等神经精神系统病史者;④有言语障碍、认知障碍者;⑤体内有金属残留物者（包括义齿、起搏器、神经刺激器、医疗泵等）;⑤对TMS畏惧以及其他原因不能进行TMS刺激者;⑥妊娠期者。

1.4 脱落标准

①志愿者未能按要求在规定时间内完成研究者;②志愿者因个人原因不能配合安排,或依从性差,不适合继续进行研究者;③试验过程中出现不适或不良反应者;④自行退出者。

2 干预方法

15例健康志愿者均接受4种干预,按随机顺序进入4组（A、B、C、D组）,组间洗脱期为1周。试验期间志愿者完全放松,眼睛睁开。

2.1 A组

为PAET25干预,由电针刺激与TMS刺激相结合。电针刺激位置为右上肢内关穴及旁开1 cm处（华佗牌针灸针0.25 mm×25 mm）,电刺激器负极连接内关穴处的针灸针,正极连接内关穴旁开1 cm的针灸针,调整刺激强度以观察到右手肌肉抽动、患者耐受、不大于三倍感觉阈为度（1.3～4.2 mA）。TMS刺激位置为右手拇短展肌的运动皮层最佳刺激点,TMS刺激强度为MEPs-1mv。PAET25由 225对关联刺激组成,频率为0.25 Hz,总时间为15 min,在每一对刺激中,电针刺激先于TMS刺激25 ms发出。

2.2 B组

为PAS25干预,由经皮正中神经电刺激与TMS刺激相结合。经皮正中神经电刺激位置为右侧腕部正中神经在体表的走行处（距离腕横纹约 3 cm）,在此位置放置表面电极,负极置于肢体近端,正极置于肢体远端,刺激强度为三倍的感觉阈（3.6～7.2 mA）。TMS刺激位置为右手拇短展肌的运动皮层最佳刺激点,刺激强度为 MEPs-1mv。PAS25由225对关联刺激组成,频率为0.25 Hz,总时间为15 min,在每一对刺激中,电刺激先于TMS刺激25 ms发出。

2.3 C组

为单纯电针干预。为了确定PAET25引起的MEPs波幅变化是否依赖于PAET25关联刺激,或者仅反映电针诱导的效应,在相同频率0.25 Hz下发出225个电针刺激后评估了运动皮层状态（电针位置和强度同A组）。

2.4 D组

为单纯rTMS干预。为了确定PAET25引起的MEPs波幅变化是否依赖于 PAET25关联刺激,或者仅反映rTMS诱导的效应,在相同频率0.25 Hz下发出225个TMS刺激后评估了运动皮层状态（TMS位置、强度同A组）。

3 干预效果

3.1 设备及操作程序

所有志愿者均在干预前后行 TMS检测,记录运动诱发电位（motor evoked potentials, MEPs）波幅、潜伏期、静息运动阈值（resting motor threshold, RMT）及皮质静息期（cortical silent period, CSP）。①准备工作。用软尺测量志愿者的前后正中线（鼻根至枕后隆凸连线）及左右正中线（左右两耳屏连线）,两线相交的中心点为CZ点,CZ至左耳屏方向5 cm的坐标点为M1点,以M1点为中心标记一个各点相距1 cm的九宫格。②TMS操作。经颅磁刺激器（Magstim200型,英国Magstim公司）选择单脉冲,SPM模式,选用八字线圈,刺激强度从 60%开始,线圈与前后正中线切线呈 45°角,每次刺激间隔5 s。③生理记录仪（Nicolet Viking Quest, Wisconsin, USA）记录右手拇短展肌的 MEPs波幅、潜伏期、RMT及CSP。记录电极接右手拇短展肌肌腹,参考电极接第一掌指关节处,地线接桡骨茎突旁。④确定最佳刺激点。在标记的九宫格内各点逐点刺激,若生理记录仪未出现 MEPs,则逐渐增加刺激强度,能诱发出最大且相对重复的MEPs的点为最佳刺激点。最佳刺激点 5次刺激中,有 3次或以上能诱发出大于50 µV MEPs波幅的最小刺激强度为拇短展肌的 RMT。⑤记录最佳刺激点诱发约等于 1 mV的刺激量（MEPs-1mv,53%～82%）及 120%RMT 的刺激量（49%～82%）。采用环状电极,负极置于右手拇指约掌指关节附近,正极置于负极远端约1 cm处,测量患者的感觉阈值。

在PAS25及PAET25刺激模式中,TMS（Magstim 200型）与电刺激相结合,电刺激通过可编程刺激器发出,然后调制刺激器的刺激波形为方波,刺激频率0.25 Hz,刺激波宽为1 ms。

3.2 检测指标

3.2.1 MEPs波幅及潜伏期

干预前（T1）和干预后 0 min（T2）、10 min（T3）、20 min（T4）、30 min（T5）、40 min（T6）、50 min（T7）、60 min（T8）以120%RMT的输出刺激量在皮层最佳刺激点记录10个MEPs波幅及潜伏期,计算其平均值,检测时右手处于放松状态。

3.2.2 CSP

干预前（T1）和干预后 0 min（T2）、10 min（T3）、20 min（T4）、30 min（T5）、40 min（T6）、50 min（T7）、60 min（T8）以120%RMT的输出刺激量在皮层最佳刺激点记录10个CSP,计算其平均值。先记录右手拇短展肌的最大外展力（0.90～3.00 kg）,检测时右手拇短展肌维持最大外展力的20%（0.18～0.60 kg）。

3.2.3 RMT

干预前（T1）和干预后 0 min（T2）、30 min（T5）、60 min（T8）检测RMT。检测时右手处于放松状态。

3.3 统计学分析

采用SPSS21.0软件对数据进行统计学分析。通过重复测量方差分析（ANOVA）将所有试验过程中收集的数据进行分析。MEPs的波幅、潜伏期、CSP比较的是干预前后数值与干预前数值的比值（%）,RMT比较的是数据的绝对值。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,组内比较使用以“时间”为因素的单因素重复方差分析,组间比较使用以“干预×时间”为因素的双因素重复测量方差分析。若重复测量方差分析不满足Mauchly's球形检验,使用Greenhouse-Geisser方法校正。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3.4 干预结果

3.4.1 各组干预前后MEPs波幅（%）的变化

组内比较,A组的MEPs波幅（%）与“时间”因素的交互效应存在统计学意义[F（3.894,54.517）＝13.755,P＜0.01]。A组内成对比较中,T2～T8与 T1的差异均有统计学意义（P＜0.01）。A组干预后,MEPs波幅（%）随时间升高,T2～T8均较T1升高,MEPs波幅（%）在T6时达到最大值,后逐渐回落。B组的MEPs波幅（%）与“时间”因素的交互效应存在统计学意义[F（7,98）＝10.000,P＜0.01]。B 组内成对比较,T2～T8与T1的差异均有统计学意义（P＜0.01）。B组干预后,MEPs波幅（%）随时间升高,T2～T8均较T1升高,在T5时达到最大值,后逐渐回落。C组及D组的MEPs波幅（%）与“时间”因素的交互效应均无统计学意义（P＞0.05）。C组、D组干预后,T2～T8的 MEPs波幅（%）较T1均无明显变化（P＞0.05）。详见表1。

各组间比较,使用“干预×时间”双因素重复方差分析,显示干预方法和时间的交互效应对MEPs波幅（%）的影响存在统计学意义[F（15.488,289.101）＝7.503,P＜0.01],提示4组随时间的变化存在差异。干预后各组间同一时点 MEPs波幅（%）比较,结果显示 A组高于C组及D组,B组高于C组及D组,差异均具有统计学意义（P＜0.01）,A组与B组差异不具有统计学意义（P＞0.05）。详见表 1。

表1 各组干预前后MEPs波幅（%）的变化情况 （±s）

表1 各组干预前后MEPs波幅（%）的变化情况 （±s）

注:与干预前（T1）比较 1）P＜0.01;与 A 组比较 2）P＜0.01;与 B 组比较 3）P＜0.01

时间 A组（15例） B组（15例） C组（15例） D组（15例）干预前（T1） 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00干预后 0 min（T2） 131.84±25.091） 140.34±25.821） 95.97±9.932）3） 105.13±9.242）3）干预后 10 min（T3） 143.51±39.071） 137.42±25.381） 95.73±10.232）3） 100.09±8.662）3）干预后 20 min（T4） 162.14±33.501） 147.45±37.201） 99.87±6.902）3） 101.83±8.192）3）干预后 30 min（T5） 164.27±44.811） 150.23±29.331） 101.61±7.072）3） 99.87±5.602）3）干预后 40 min（T6） 170.78±45.821） 147.63±24.661） 103.85±11.202）3） 104.13±7.572）3）干预后 50 min（T7） 156.05±34.601） 141.07±29.691） 100.17±9.252）3） 104.84±9.532）3）干预后 60 min（T8） 156.39±44.731） 143.49±31.761） 98.93±10.552）3） 103.65±8.592）3）

3.4.2 各组干预前后CSP（%）的变化

组内比较,B组的CSP（%）与“时间”因素的交互效应存在统计学意义[F（7,98）＝7.582,P＜0.01]。B组内成对比较中,T2～T8与T1的差异均存在统计学意义（P＜0.01）。B 组干预后,T2～T8的 CS（%）P均较 T1 升高。A组、C组及D组的CSP（%）与“时间”因素的交互效应均无统计学意义（P＞0.05）。A组、C组及D组干预后,T2～T8的CS（%）较T1均无明显变化（P＞0.05）。详见表2。

各组间比较,使用“干预×时间”双因素重复方差分析,显示干预方法和时间的交互效应对 CSP（%）的影响存在统计学意义[F（15.488,289.101）＝7.503,P＜0.01],提示4组随时间的变化存在差异。干预后各组间同一时点 CSP（%）比较,结果显示 B组高于 A组、C组及D组,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。详见表2。

表2 各组干预前后CSP（%）的变化情况 （±s）

表2 各组干预前后CSP（%）的变化情况 （±s）

注:与 B 组比较 1）P＜0.01;与干预前（T1）比较 2）P＜0.01

观察时点 A组（15例） B组（15例） C组（15例） D组（15例）干预前（T1） 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.001） 100.00±0.001）干预后 0 min（T2） 101.11±10.581） 114.94±12.662） 101.65±5.691） 100.57±4.351）干预后 10 min（T3） 102.11±10.191） 114.50±15.692） 103.61±9.811） 101.39±8.701）干预后 20 min（T4） 101.06±11.551） 116.19±12.362） 103.96±9.431） 100.49±9.011）干预后 30 min（T5） 104.42±14.441） 117.89±16.552） 100.89±8.491） 105.30±15.611）干预后 40 min（T6） 102.63±11.731） 124.05±15.172） 102.47±8.101） 105.36±10.431）干预后 50 min（T7） 103.34±12.501） 124.40±16.102） 105.46±10.891） 103.88±7.751）干预后 60 min（T8） 101.99±13.791） 123.13±18.852） 104.26±10.561） 103.19±8.201）

3.4.3 各组干预前后MEPs的潜伏期（%）的变化

组内比较,4组的MEPs潜伏期（%）与“时间”因素的交互效应均无统计学意义（P＞0.05）。A组、B组、C组、D组干预后 MEPs潜伏期（%）较 T1均无明显变化（P＞0.05）。详见表 3。

表3 各组干预前后潜伏期（%）的变化情况 （±s）

表3 各组干预前后潜伏期（%）的变化情况 （±s）

观察时点 A组（15例） B组（15例） C组（15例） D组（15例）干预前（T1） 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00干预后 0 min（T2） 100.22±2.51 99.78±2.32 100.63±2.69 100.15±2.12干预后 10 min（T3） 99.76±3.32 99.96±2.43 100.31±2.01 100.50±1.41干预后 20 min（T4） 99.79±3.07 100.04±2.19 100.09±2.72 100.36±1.54干预后 30 min（T5） 99.42±2.71 99.22±2.78 100.20±2.40 100.58±2.19干预后 40 min（T6） 100.31±3.55 99.83±2.40 100.04±2.98 99.78±2.54干预后 50 min（T7） 99.50±3.61 100.25±2.18 99.97±2.73 99.92±2.59干预后 60 min（T8） 100.56±3.81 99.46±2.46 100.48±2.80 100.30±1.89

各组间比较,使用“干预×时间”双因素重复方差分析,显示干预方法和时间的交互效应对 MEPs潜伏期（%）的影响无统计学意义（P＞0.05）。提示 4组的MEPs潜伏期（%）随时间的变化无明显差异。

3.4.4 各组干预前后RMT的变化

组内比较,A组的RMT与“时间”因素的交互效应存在统计学意义[F（3,42）＝3.160,P＝0.034＜0.05]。A组内成对比较中,T2与T1的差异无统计学意义（P＞0.05）,T5与 T1的差异存在统计学意义（P＝0.027＜0.05）,T8与 T1的差异存在统计学意义（P＝0.014＜0.05）。A组干预后,RMT较 T1降低。B组、C组及D组中的RMT与“时间”因素的交互效应均无统计学意义（P＞0.05）,提示B组、C组及D组干预后的RMT均无明显变化。详见表4。

各组间比较,使用“干预×时间”双因素重复方差分析,显示干预方法和时间的交互效应对 RMT的影响无统计学意义（P＞0.05）。提示4组的RMT随时间的变化无明显差异。详见表4。

表4 各组干预前后RMT的变化情况 （±s）

表4 各组干预前后RMT的变化情况 （±s）

注:与干预前（T1）比较 1）P＜0.05

观察时点 A组（15例） B组（15例） C组（15例） D组（15例）干预前（T1） 52.27±7.69 53.00±6.98 52.20±5.27 50.53±6.20干预后 0 min（T2） 52.07±7.79 52.60±6.90 52.20±5.70 50.67±6.33干预后 30 min（T5） 51.60±7.731） 52.47±7.09 52.20±5.78 50.67±6.43干预后 60 min（T8） 51.80±7.551） 52.80±6.94 52.27±5.80 50.60±6.31

4 讨论

本试验中使用的MEPs波幅、潜伏期、CSP及RMT均可反映运动皮层兴奋性的变化。MEPs是指以单脉冲TMS作用于大脑运动皮层时,在相应靶肌肉位置记录到的电信号。MEPs波幅是指运动诱发电位从波峰到波谷的垂直距离,MEPs潜伏期是指从皮层到靶肌肉的传导时间。若周围神经完整,MEPs的波幅和潜伏期反应皮质脊髓束的完整性及运动皮层的兴奋性。RMT是指最佳刺激点5次输出刺激中,有3次或以上能诱发出≥50 µV MEPs波幅时的最小刺激强度。RMT的检测主要用于评价皮质脊髓束的兴奋性。CSP是在肌肉持续收缩的过程中,给予单个 TMS刺激后,在 TMS刺激诱发MEPs波形后出现的一段肌肉电活动被抑制的时期。一般认为在 CSP发生过程中,皮层内抑制现象占据了主导地位,CSP持续时间反映了由 GABA（γ-氨基丁酸）介导的抑制性神经回路的兴奋性[9]。

本研究结果表明,健康志愿者经PAS25或PAET25干预后,MEPs波幅增加,时间至少可持续 60 min,与Stefan K等[1]和 Ziemann U等[10]观察到的效应相似,提示PAET25对初级运动皮层可产生与兴奋性PAS模式类似的LTP效应。而单纯电针或单纯rTMS干预后MEPs波幅均无明显变化,说明MEPs波幅变化依赖于PAET25联合刺激模式,而非仅反映单纯电针或是单纯rTMS的效应。PAS25干预后,CSP较干预前升高,PAET25、rTMS、电针干预后CSP无明显变化。其他研究中对健康志愿者进行PAS25干预后,均观察到MEPs波幅及CSP的增加[1,11],这与本研究中PAS25组结果相似,而PAET25组干预后,MEPs波幅升高、CSP无明显变化,这可能与针刺复杂的感觉传入有关,具体的机制尚不明确,仍需进一步研究分析。单纯电针及单纯rTMS干预后CSP均无明显变化。PAET25干预后,RMT较干预前降低,而4组间的比较无明显差异。4组干预后潜伏期均无明显变化。

PAS是由多个成对刺激（TMS配对外周神经传入的电刺激）组成的刺激序列,调整两种刺激之间的顺序及间隔,可以调节大脑运动皮层兴奋性。当电刺激先于磁刺激发出（目前应用的刺激间隔有 25 ms、21.5 ms、N20 ms、N20＋2 ms等）,可诱导MEPs波幅升高[1],MEPs的改变出现迅速、时间持久且可逆,与LTP效应相似。当磁刺激先于电刺激发出（目前应用的刺激间隔有10 ms、N20-5 ms等）,可诱导MEPs波幅降低[12],MEPs的改变出现迅速、时间持久且可逆,与LTD效应相似。PAS突触强度被认为受到突触前后神经元激活的触发顺序和时间的严重影响。电刺激正中神经对M1的传入被认为激活突触前细胞,而磁刺激激活突触后细胞[13]。突触前神经元先于突触后神经元数十毫秒激活一般诱发LTP效应,而逆转时间顺序则诱发LTD效应[14]。故电刺激先于磁刺激的PAS刺激模式（文中简称兴奋性PAS）一般诱发LTP效应,而磁刺激先于电刺激的PAS刺激模式（文中简称抑制性PAS）一般诱发LTD效应。本研究中应用的正是电刺激先于磁刺激发出的兴奋性联合刺激模式,选取的刺激间隔是相关研究中应用较多的25 ms。

兴奋性PAS刺激模式作为检测和评估手段被广泛应用于神经系统等疾病的脑可塑性的研究中。通过对比抑郁症与健康志愿者PAS25刺激前后运动皮层兴奋显性的变化,提供了抑郁症患者神经可塑性降低的直接证据之一[15]。对慢性偏瘫患者双侧半球进行 PAS25刺激,发现 PAS25能显著增加健侧大脑半球的募集曲线下面积,对患侧无明显影响,支持了中风后健侧大脑半球发生代偿性变化、针对慢性中风患者的疗法可以利用健侧的可塑性来帮助恢复功能这一论点[16]。通过PAS25检测 varenicline（酒石酸伐尼克兰片）对非吸烟的精神分裂患者皮质可塑性的影响,发现 varenicline可显著增加精神分裂症患者 LTP,提示varenicline在治疗精神分裂症患者认知障碍方面的潜力[17]。近年来,PAS的治疗价值逐渐被发现。对卒中后1个月、5个月及1年的患者予PAS25干预,结果显示,卒中后5个月时PAS25对大脑皮质兴奋性的易化作用最明显,1年时易化作用仍存在,且患者上肢功能也明显改善,提出可在卒中早期将 PAS作为附加疗法这一建议[18]。Michou E等[19]首次将兴奋性PAS应用于6例卒中后吞咽障碍患者,证实PAS干预可使患者双侧大脑皮质兴奋性增高,且健侧半球皮质兴奋性的增加幅度更为显著,促进卒中患者吞咽功能改善。

PAET的刺激模式与传统成对关联刺激模式主要有以下区别。①PAS是经皮刺激,不刺入皮内,PAET是电针刺激,针灸针刺入皮内;②PAS中电刺激位置是前臂正中神经体表走行位置,PAET中电针刺激位置是内关穴,内关穴位置与正中神经走行位置重叠,这为电针内关穴替代正中神经经皮电刺激与TMS组合成成对关联刺激提供了理论支持。另外,值得注意的是,本研究中的电针刺激模式与临床及科研常用模式有较大区别,在前期研究中已证实电针可调节大脑运动皮层兴奋性,一般使用 HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪,每 0.5 s发出1个电刺激（频率2 Hz）,电流强度0.5～1 mA;而本研究使用Master-8可编程刺激器,每4 s发出1个电刺激（频率0.25 Hz）,电流强度1.3～4.2 mA。目前有关PAET的研究非常少,有研究发现PAET与单纯电针均能使MEPs波幅升高,而单纯电针干预后MEPs波幅升高更明显,认为这是由于联合刺激中的rTMS抑制了皮层兴奋性并降低了MEPs波幅,提出了电针与TMS联合刺激模式无显著作用[19],与本研究的试验结果不符。造成两研究结果差异可能有以下原因。①检测时磁刺激的输出量不同,其他研究使用的输出量是80%及90%的MEPs-1mv,本研究中使用的是 120%RMT;②成对关联刺激中刺激间隔不同,其他研究使用的是正中神经体感诱发皮层电位N20潜伏期＋2 ms（N20＋2）,而本研究使用的是固定间隔25 ms。

当TMS刺激先于电刺激10 ms或N20-5 ms发出,可诱导皮层LTD效应[14,21]。有研究对PAS刺激模式进行归纳总结,发现对比抑制性PAS,兴奋性PAS似乎能导致更大的皮质兴奋性变化,认为生理敏感性的差异有利于兴奋性PAS[22]。PAS诱导的LTD效应的意义目前暂不明确,故抑制性的 PAS刺激模式在皮层可塑性研究中的应用并不多。目前关于针刺对LTD效应的研究报道比较少,在前期研究工作中,观测到针刺对大脑运动皮层的作用以兴奋效应为主[5-8]。因此,电针与 TMS成对关联刺激能否诱导稳定的LTD效应尚不明确。

综上所述,本研究表明PAET25刺激模式能诱发与兴奋性PAS模式相似的LTP效应,提示PAET25可能在脑损伤、康复治疗等方面具有潜在的治疗价值。为PAET25作为一种新型治疗模式提供了初步科学数据,其内在机制尚需进一步研究。