苦豆子总碱降血糖作用及其机制研究

刘 伟，张扬星，杨新洲，欧阳艳，赵 平*

1伊犁师范大学新疆维吾尔自治区教育厅高校天然产物化学与应用重点实验室，伊宁 835000；2中南民族大学，武汉 430074

糖尿病是一组由于胰岛素分泌或胰岛素作用缺陷引起的以高血糖和最终糖尿症为特征的代谢性疾病[1]。研究数据统计在2017年全球糖尿病患者人数为8.51亿，90%以上都为2型糖尿病(T2DM)[2]。T2DM是一种复杂的代谢失调疾病，其特征是慢性高血糖和不同程度的胰岛素抵抗(IR)[3,4]。引起IR的原因之一是葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)蛋白的表达和功能的失调[5]。胰岛素可以刺激骨骼肌葡萄糖摄取，主要是通过诱导GLUT4从细胞内储存位置向质膜移位，GLUT4向细胞表面的转运缺陷是2型糖尿病胰岛素抵抗的一个关键特征[6]。因此，了解GLUT4的转位和表达机制对防治糖尿病有着极为重要的作用，也表明其是潜在糖尿病治疗的药物靶点[7]。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)作为豆科槐属多年生草本植物，广泛分布于中国西北部各省和中亚国家，具有清热解毒、祛风解渴等功效[8]，成为了西北地区常用少数民族药材。生物碱是苦豆子中主要的化学成分之一，多数的化学与药理学研究是围绕苦豆子中的生物碱成分展开的[9,10]。苦豆子中的多数生物碱属于喹诺里西啶生物碱，是属于哌啶或吡啶的衍生物[11]，在抗炎、抗心律失常、抗肿瘤和免疫调节等方面具有重要的药理活性和应用前景[12]。近年来，有研究表明从苦豆子中提取出的总生物碱能够对DSS诱导的结肠炎小鼠有保护作用，可减轻结肠损伤，防止肠道微生物群失调，调节胆酸代谢[13]。现有关于苦豆子总碱在糖尿病方面的研究还较少，因此，本实验通过提取苦豆子中总碱，研究其降血糖效果及相关作用通路，以期充分利用苦豆子药用资源价值，为研究抗糖尿病药物提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 仪器

Thermo Forma 371直热式CO2细胞培养箱(Thermo Fisher公司)；Olympus IX 81倒置显微镜(Olympus公司)；Tecan M200 PRO多功能酶标仪(Tecan公司)；DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；Rio-Rad Chemidoc XRS化学发光凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；LSM700 激光共聚焦显微镜(Zeiss公司)。

1.2 药品与试剂

苦豆子地上部分于2018年7月采于新疆伊犁，经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定为苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)的地上部分，植物样本保存于中南民族大学标本馆。

BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，Lot：082820201207)；PAGE凝胶快速制备试剂盒(10%)(上海雅酶生物医药科技有限公司，Lot：04542025)；葡萄糖(GLU-OX)检测试剂盒(氧化酶法)(英科新创有限公司，Lot：7008240303)；特灵敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，Lot：121720210418)；MTT(德国BioFroxx公司，Lot：EZ2811A179)；Anti-Akt、Anti-p-Akt、Anti-β-actin、Anti-GLUT4、Anti-AMPKα、Anti-p-AMPKα、Anti-p-PKC(pan)(Cell signaling technology公司，Lot：28、30、18、7、21、2、2)；HRP-goat anti rabbit IgG、HRP-goat anti mouse IgG(CWBIO 公司，Lot：01332/40242；00393/50537)；α-Minimal Essential Medium(α-MEM，美国Gibco公司，Lot：8121273)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，Lot：19050501)。

PSS生理盐溶液：135 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl2，1 mM MgCl2，10 mM HEPES，10 mM Glucose，加水定容至1 L，用5 mol/L NaOH调节pH至7.4。

1.3 细胞

L6-myc-GLUT4-mOrange细胞：稳定表达转染了红色荧光蛋白myc-GLUT4-mOrange的L6骨骼肌细胞。

1.4 方法

1.4.1 苦豆子总碱的提取

取干燥的苦豆子地上部分1 kg，粉碎，用95%的乙醇室温下提取4次，合并多次提取液，减压浓缩至无醇味即得浸膏150 mL。将浸膏加200 mL热蒸馏水分散后，加10% H2SO4调pH至2～3左右，然后用石油醚萃取多次除去脂肪酸等小极性成分，之后将溶液加氨水调节至pH值为10左右，再次用乙酸乙酯萃取多次得苦豆子总生物碱部位(TASA，23 g)。

1.4.2 L6骨骼肌细胞的培养和诱导分化

将稳定表达转染了红色荧光蛋白myc-GLUT4-mOrange的L6骨骼肌细胞在含10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基于37 ℃，5% CO2条件下培养，当细胞生长至80%左右，换为含2%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基进行诱导分化。隔天换液，诱导分化培养5～7天，至80%的细胞生长出肌管，即得到分化成熟的成肌细胞。

1.4.3 L6骨骼肌细胞葡萄糖摄取实验

为测定TASA对L6骨骼肌细胞葡萄糖摄取的刺激作用。首先，将L6骨骼肌细胞接种于96孔板中，每个实验组设置10个重复孔，同时设置空白对照组(control,Con)、阳性对照胰岛素组(insulin,Ins)和药物组。待细胞汇合到80%左右后，换成含2%胎牛血清的α-MEM培养基分化5～7天。接下来将96孔板中培养的细胞用不含血清的α-MEM基础培养基饥饿2 h，然后分别加入100 μL的15、30、60 μg/mL TASA(TASA-15、TASA-30、TASA-60)、100 nM胰岛素和无血清α-MEM(空白对照)后，放入37 ℃，5% CO2的培养箱中培养30 min，另取一个新的96孔板，按照试剂盒说明书对每孔加入200 μL葡萄糖氧化酶试剂，并另取一排加入氧化酶试剂后加入2 μL葡萄糖标准液，从旧96孔板中一对一地取上清液2 μL加入到新板中，30 min内用酶标仪于505 nm处测量吸光值。

1.4.4 MTT法检测TASA作用L6骨骼肌细胞药物毒性

按照“1.4.3”方法加入无血清α-MEM培养基和不同浓度TASA作用L6骨骼肌细胞30 min后，吸去培养基及药物，每孔加入100 μL用α-MEM稀释的MTT溶液(5 mg/mL)，放入细胞培养箱避光培养4 h后，吸去MTT，再向每孔内加入150 μL DMSO溶液后，测量490 nm处吸光值。

1.4.5 激光共聚焦显微镜检测L6骨骼肌细胞中GLUT4的转运

当L6-myc-GLUT4-mOrange细胞长到适合传代密度时，将其接种在经95%酒精灭菌后的无菌盖玻片上，于培养箱中过夜培养使其完全的贴壁，然后利用不含血清的α-MEM基础培养液饥饿细胞2 h后，再用PSS生理盐溶液清洗，将饥饿的细胞放置在激光共聚焦显微镜之下，加入200 μL PSS生理盐溶液，于555 nm激发波长下观测myc-GLUT4-mOrange的荧光转位的动态变化。观察并记录加入30 μg/mL TASA后5 min内myc-GLUT4-mOrange的荧光强度的变化，并计算GLUT4在胞内的转运。

1.4.6 总蛋白的提取

将分化5～7天的细胞用无血清α-MEM基础培养基饥饿2 h，然后分别加入阳性对照和不同浓度的TASA作用30 min后，立即将培养皿放于冰上，弃去含药物的培养基．终止药物的作用，并用预先在4 ℃预冷的PBS洗涤细胞3次后吸干，每皿加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液100 μL。用1 mL枪头底部将细胞尽量均匀地刮起；并收集于1.5 mL EP管中，再依次用27孔径和12孔径注射器进行多次的抽提破碎30次，全部操作必须保持在冰上完成。利用冷冻离心机在4 ℃，12 000 rpm的条件下，对破碎后的细胞进行冷冻离心处理10 min，再小心地吸取上清，弃去沉淀，上清液即为细胞总蛋白。按照Beyotime BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书对蛋白浓度进行检测。根据收集所得的蛋白浓度及体积，加入相对应体积的5×SDS-PAGE loading buffer，振荡后置于95 ℃金属加热器上变性10 min，-20 ℃保存备用。

1.4.7 Western blot检测GLUT4及相关信号通路蛋白表达情况

取等量蛋白质样品上样，使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，并转膜至NC膜，利用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，之后用TBST洗膜3次，每次10 min，再加入稀释后的AKT、p-AKT、β-actin、GLUT4、AMPKα、p-AMPKα和p-PKC(pan)一抗，4 ℃摇床上孵育过夜。之后再用TBST洗膜3次，每次10 min，室温摇床孵育稀释的二抗1 h。使用ECL化学发光液显色发光，凝胶成像系统显影及配套软件计算灰度值。

1.4.8 统计学处理

2 结果

2.1 TASA对L6骨骼肌细胞内葡萄糖摄取的影响

利用葡萄糖检测试剂盒研究了TASA对于L6骨骼肌细胞内葡萄糖摄取的情况。如图1所示，以Ins作为阳性对照，并设立空白对照组和实验组，结果证明使用100 nM Ins和不同浓度的TASA分别处理L6细胞，两者都能明显促进L6细胞对葡萄糖的摄取。

图1 不同浓度的TASA处理对L6细胞葡萄糖摄取的影响Fig.1 Effect of TASA with different concentrations on glucose uptake of L6 cells注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。NS表明无显著性差异，下同。Note:Compared with control,*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001.NS showed no significant difference The same below.

2.2 TASA对L6骨骼肌细胞的毒性影响

利用MTT法对TASA作用于L6骨骼肌细胞进行了细胞毒性检测。结果如图2所示，15、30、60 μg/mL浓度的TASA作用细胞30 min后，均对细胞无明显毒性作用，说明TASA具有成为降糖药的良好潜质。

图2 TASA对L6细胞的毒性影响Fig.2 Toxic effect of TASA on L6 cells

2.3 TASA促进L6骨骼肌细胞内GLUT4的转位

为进一步探究TASA促进L6骨骼肌细胞内葡萄糖摄取的作用机理，利用激光共聚焦显微镜监测L6-myc-GLUT4-mOrange细胞中myc-GLUT4-mOrange的荧光强度的动态变化，来反映L6骨骼肌细胞中GLUT4的转位情况。如图3A、3B所示(Basal是指基础状态，即加药前状态)，发现30 μg/mL TASA作用细胞1 min时即能显著增加细胞膜上myc-GLUT4-mOrange荧光强度，且呈现时间依赖性，表明TASA能促进GLUT4易位到细胞膜上，进而促使L6骨骼肌细胞内葡萄糖摄取。

图3 TASA处理对L6细胞内GLUT4的转位(标尺：50 μm)Fig.3 Effect of TASA treatment on translocation of GLUT4 in L6 cells (scale:50 μm)注：A.Confocal监测L6-myc-GLUT4-mOrange细胞中myc-GLUT4-mOrange每分钟荧光强度动态变化；B.加药处理后相对应的荧光变化曲线。Note:A.Confocal was used to monitor the dynamic changes of fluorescence intensity per minute of myc-GLUT4-mOrange in L6-myc-GLUT4-mOrange cells;B.The corresponding fluorescence curve after the treatment of adding medicine.

2.4 TASA促进L6骨骼肌细胞中GLUT4的蛋白表达

利用Western blot检测TASA作用L6骨骼肌细胞后GLUT4的蛋白表达情况，实验结果发现，与对照组相比，加入100 nM胰岛素的阳性对照组和分别加入15、30、60 μg/mL的TASA作用细胞30 min后能够增加GLUT4的蛋白表达，且呈浓度依赖性(见图4A、4B)。结果表明TASA能够促进L6细胞中GLUT4的蛋白表达水平增加。

图4 TASA处理对L6细胞内GLUT4蛋白表达影响Fig.4 Effect of TASA treatment on GLUT4 protein expression in L6 cells

2.5 TASA增强了L6骨骼肌细胞内AMPK和PKC信号通路的磷酸化水平

体内GLUT4细胞膜转位受多种信号通路的影响，主要涉及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路等。因此，本研究进一步验证TASA促进GLUT4转位和表达是通过哪种信号通路。由蛋白磷酸化实验结果显示，TASA能够增加AMPK和PKC信号通路中蛋白的磷酸化水平，且呈浓度依赖性(见图5A、5B)，但经TASA处理后的细胞的AKT磷酸化现象没有显著变化(见图5C)。这些发现支持了TASA是通过AMPK和PKC信号通路促进GLUT4表达和转位。

图5 TASA通过促进L6细胞中AMPK和PKC信号通路的磷酸化诱导GLUT4表达Fig.5 TASA induced GLUT4 expression by promoting phosphorylation of AMPK and PKC signaling pathway in L6 cells注：A.100 μg/mL阳性药二甲双胍(MET)和不同浓度TASA处理细胞30 min后，其AMPK磷酸化水平显著升高；B.200 nM阳性药佛波酯(PMA)和不同浓度TASA处理细胞30 min后，其PKC磷酸化水平显著升高；C.不同浓度TASA处理细胞30 min后，对AKT磷酸化水平无影响。Note:A.The phosphorylation level of AMPK increased significantly after 100 μg/mL positive drug Metformin (MET) and different concentrations of TASA treatment for 30 min;B.The phosphorylation level of PKC increased significantly after 200 nM positive drug PMA and different concentrations of TASA treatment for 30 min;C.The phosphorylation of AKT was not affected by different concentrations of TASA for 30 min.

3 讨论与结论

2型糖尿病(T2DM)是一种复杂的慢性糖代谢紊乱疾病，其发病率一直呈上升趋势。目前针对2型糖尿病治疗的传统药物主要是二甲双胍、胰岛素、磺脲类药物及其他口服降糖药，而新型的降糖药主要有胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂、二肽基肽酶4抑制剂(DPP-4i)等[14]，这些药物或多或少都存在一定的副作用。而从天然植物中提取的传统药物已被证明比现代药物更经济，临床疗效好且副作用相对较少[15]，因此寻求相对安全的药用植物在糖尿病的治疗中已变得越来越重要。

中药治疗糖尿病的主要成分按化学结构可分为生物碱类、多糖类、皂苷类、黄酮类等几大类[16]。有研究表明，天然药物生物碱类成分中具有显著降血糖活性的异喹啉生物碱类小檗碱能增强胰岛素诱导的糖摄取及GLUT4转位，改善胰岛素抵抗[17]。哌啶生物碱类胡椒碱通过激活L6细胞内AMPK上游通路，进而磷酸化AMPK诱导GLUT4转位至质膜[18]。苦豆子总碱是从药用植物苦豆子中提取出的碱类，其是含有槐果碱、槐定碱、苦参碱等多种生物碱的总称[19]，现有的研究表明，苦豆子总碱在抗肿瘤、抗微生物、降血压等[20]方面起着一定药理作用，但还鲜有关于对糖尿病研究的报道。因此，本实验从苦豆子地上部位提取出总碱来研究其降糖作用。

体内GLUT4细胞膜转位受多种信号通路的影响，影响GLUT4转位的一个重要通路是胰岛素介导的信号效应通路，即胰岛素可与胰岛素受体(insulin receptor，IR)结合后，通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路调节糖原合成、葡萄糖的摄取和降解，从而发挥调节血糖的作用[21,22]。本实验以L6细胞为研究对象，发现TASA作用细胞后的AKT磷酸化水平没有显著变化，说明TASA的降糖作用不影响AKT通路。骨骼肌葡萄糖摄取还可以通过胰岛素非依赖性AMPK通路激活骨骼肌葡萄糖摄取和利用，其机理是AMPK被激活后，会引起TBC1D1的磷酸化，进而上调下游信号分子GLUT4的表达，并促进GLUT4从细胞内向细胞膜转运，增加细胞对葡萄糖的吸收和利用[23]。PKC可分为多种激酶亚型包括典型PKC(PKC-α、PKC-β、PKC-γ)，新型PKC(PKC-ε、PKC-η、PKC-θ)和非典型PKC(PKC-ζ、PKC-λ)，研究结果表明使用PKC-ζ抑制剂后，胰岛素刺激下的葡萄糖转运受到抑制，而PKC-ζ的活化可增加葡萄糖转运[24]。本实验通过研究TASA对细胞AMPK和PKC通路影响，发现AMPK和PKC磷酸化水平均升高，提示TASA可能通过激活AMPK和PKC通路来进一步上调GLUT4表达。

综上所述，基于GLUT4为作用靶点，本实验围绕TASA对GLUT4的表达和转位作用展开研究，结果发现TASA能够有效增加L6骨骼肌细胞内葡萄糖的摄取和GLUT4的转位和表达，由进一步的机制研究发现TASA作用GLUT4的蛋白表达是通过AMPK和PKC两种信号通路来促进。这些结果发掘出TASA在治疗糖尿病方面的潜力。然而该研究还缺乏TASA在活体水平上的相关实验，之后的研究将通过TASA作用于2型糖尿病小鼠模型来观测其对活体模型的血糖及相关指标的影响。