洞角的研究进展

张 磊，王凤红，李晓凯，乔 贤，龚 高，严晓春，张令天，王志英,2,3，王瑞军,2,3,，刘志红，2，3，王志新，2，3，何利兵，张燕军，2，3，李金泉，2，3*，苏 蕊，2，3*

(1. 内蒙古农业大学 动物科学学院,呼和浩特 010018；2. 农业农村部肉羊遗传育种重点实验室，呼和浩特 010018；3. 内蒙古自治区山羊遗传育种工程技术研究中心,呼和浩特 010018；4. 内蒙古金莱牧业科技有限责任公司,呼和浩特 010018)

“角”的由来可以追溯到商朝后期的甲骨文，取自牛、羊头上角的形状，其中的曲线代表角纹，后来泛指所有动物的角。目前现存的哺乳动物中只有反刍动物是唯一具有角的动物类群[1]。最早出现的有角动物大约在4 500万年前。角为哺乳动物特有，是与头骨连接的衍生物[2]，形态各异，如牛、羊的角、鹿科动物的角枝等，在对抗天敌、自卫和争夺交配权及信息交流中有重要作用[3]，且按组织学结构主要分为洞角(牛、羊)、犀角(犀牛)、实角(鹿)、羚角(叉羚羊)和瘤角(长颈鹿)五种类型[4]。在古代，人们利用牛角作为牵牛耕地的基础，角因此被视为生产力的一种；同时角还是力量的象征，常被用来作为神圣的器物进行供奉；角的材质与指甲、蹄和羽毛等角质结构类似，均来源于上皮组织。随着人们对角的认识逐渐加深，角的用途也进一步被挖掘。古人不仅使用兽角作为军中演奏的乐器，还作为酒器或量器。此外，由于动物角成分不同，还能作为药材和装饰品(表1)。

表1 洞角的药用功效Table 1 The medicinal efficacy of the hollow horn

中国是农牧业发展大国，种质资源十分丰富。随着养殖水平的不断提高，无角动物受到了人们的钟爱。从饲养环境来讲，在现代密集饲养条件下，有角动物易对饲养人员和同伴造成撞伤，从而影响家畜的胴体、毛皮质量且容易发生感染，对养殖业造成直接的经济损失；从饲料转化率来讲，角的生长需要很多的营养物质转化而成，消耗了饲料，增加了成本。因此，亟待加强对角性状的研究，为培育无角动物提供参考依据，以期节省饲养成本，提高经济效益。

洞角是牛科动物特有的角，是进化最完善且种类繁多的一类角，科以下约有49属59种，主要由真皮骨心和表皮角质鞘两部分组成。骨心的内部中空，故名为洞角，里面有微小的乳头和毛细血管。角质鞘作为角的最外层，可以保护骨心[12]。洞角形态多样，有的短小(麂羚)、有的粗壮(塬羊)、有的细直(剑羚)、有的短而弯曲(羚牛)，主要与其发生发育相关[13]。洞角生长时，首先在额骨上方出现类似于球形的骨质体(角骨)，作为洞角轴，由真皮衍生而来，最终与头盖骨结合，完成角的发生。角的发育始于表皮的角质层(中胚层)组织分化和重塑的结果[14]，即结缔组织膜之下形成的膜内成骨，其生长主要在边缘-扩大骨骼面积和外表面-增大骨骼厚度。而角心的生长则依靠尖端部位的骨骼生长及外表面的加粗，这样层层累积，形成角轮，也导致其形状多样或弯曲或旋转或直立。角的超微结构表明，角神经作为角的一部分附着在角上，与眼神经关联[15]。本文以牛角和羊角为例，综述了角的起源、驯化以及与结构、发育候选基因相关的研究进展等内容，为探索无角性状的形成机理提供理论基础。

1 牛 角

1.1 起源及驯化

有角牛驯化距今约10 500年，出现在中东地区[16]，由于其产量和肉质优势，被广泛饲养，成为生活中主要的肉食来源。无角家养牛最早出现在公元前6 000年的德国[17]，考古学家认为无角牛最早出现新石器时代后期[18]，然而古埃及出现的壁画表明，在人类早期就出现了无角牛[19]。经过培育出现了短角牛等优良品种，随后人们便开始了对牛角的大小和有无进行了探索，并取得了显著的成果[20]。

1.2 形态结构及发育

从外形上看，牛角大部分为半圆形，长度、粗细大小不等，可能由品种、性别决定。牛角结构由是角基、角体和角尖三部分组成。角基是角相对柔软的一部分，从皮肤长出体表，包围角的外周，决定角的粗细；角体是角基延伸到向角尖的部分，决定角的长短；角尖一般为充满角质的实体，在争斗中起到重要作用。角的表面有角轮，呈现环状的隆起。角基中的角轮最大且最明显，然后是角体，角尖中最小甚至没有角轮。从内部结构观察，由角质小管和管间角质构成牛角的角质外壳，并且角质小管排列非常紧密，管间角质较少。牛角形成大致历经268 d，分别从出现角原基(70 d)、神经束(115 d)、皮脂腺(155 d)、前额皮肤区(172 d)、角芽(212 d)、前额皮肤完全分化(268 d)。而无角表型个体角发育与有角个体一致，在胎儿期不能区分[22]。从遗传上看，角的有无为质量性状，Dove等[23]以荷斯坦牛为研究对象，对角的有无进行研究，通过骨膜移植术的方法，对无角的荷斯坦犊牛进行骨膜移植，随着犊牛的生长最终长出了角，结果表明角由来自真皮和皮下结缔组织的骨核发育而来，经骨核融合，最终形成角。

图1 不同品种牛角图片[21]Fig.1 Cattle horns of different breeds[21]

1.3 候选基因研究现状

随着人们对角性状认识的逐渐加深及无角动物的出现，人们不仅限于关注角的表型，开始探索其分子机制。无角基因(P)对有角基因(p)为显性，但显性不完全，在牛1号染色体着丝粒区域，大小为1Mb[24-26]，其着丝粒边界在 RP42218J17_MS1，端粒边界BM6438[27-28]。Georges等[29]证明了无角性状位点和两个微卫星标记gmpoll-1和gmpoll-2之间遗传连锁，将相应的连锁群定位到牛的1号染色体上；无角分子标记的成功挖掘，为后期通过标记辅助选择培育无角动物的育种规划奠定基础。随着牛基因组组装精度日益完善，Wiedemar等[30]通过芯片测序对无角牛进行基因分型发现1号染色体上存在两种与无角表型相关的单倍型。

Rothammer等[20]解析了荷斯坦牛无角表型的主要机制是由于1号染色体上插入一段80 kb的序列导致。Mariasegaram等[31]通过不同群体(海福特牛群和婆罗门牛群)对国际上公布的33个无角位点进行验证，在此基础上新验证了16个位点，并定位在IFNAR2 和 SYNJI 的区域，同时发现了CSAFG29与无角位点基因呈现强相关，与无角基因连锁不平衡，因此断定CSAFG29是无角性状潜在的特征标记。Cargill等[32]对荷斯坦奶牛角的有无进行多态性分析，表明SYNJ1_C3981T与牛的有角和无角相关，可作为角性状有无的候选基因。楚康康等[33]利用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对有角荷斯坦牛、无角安格斯牛以及无角海福特牛SYNJ1基因的3′UTR进行分析，发现SYNJ1基因C3981T位点的SNP与牛角的有无并不存在关联；Wöhlke等[34]在不同品种牛群体同样证明了C3981T位点的SNP与牛的有角和无角不相关。Aureélien等[35]发现在牛2号染色体上一段3.7 Mb的基因片段中ZEB2位点是参与牛角的发育过程，是一个不同于1号染色体上的新位点，同时揭示了上皮-间质转化在角芽分化中起着关键作用。Allais-Bonnet等[36]再次提供了OLIG2、FOXL2和RXFP2参与角芽分化的证据，并得出了牛、羊和山羊无角位点之间的关联，为理解牛科动物角芽分化的遗传途径奠定基础。牦牛角的遗传符合孟德尔遗传[37]。Liang等[38]以牦牛角有无性状为目标性状，通过GWAS方法，找到无角性状的位点，并注释出3个蛋白编码基因，表明除蛋白质结构变异以外的表达变异是无角表型的主要原因，为建立牦牛无角区域基因组结构迈出重要的一步，同时为理解牛科动物无角性状的遗传基础提供新的见解。赵娟花等[39]对控制牦牛角有无的候选基因通过实时荧光定量PCR方法在角基中进行验证，表明C1H21orf62和RXFP2基因在有角牛(表达量低)和无角牛(表达量高)中表达量差异显著，OLIG2基因仅在无角牛个体中表达，进一步说明OLIG2基因为无角牦牛的关键基因。李明娜等[40]利用qPCR技术对有角牦牛和无角牦牛的候选基因SYNJ1、GCFC1和C1H21orf62进行表达量分析研究，结果发现这3个基因表达均无显著差异，排除其作为角有无候选基因的可能。Liu等[41]在牦牛角性状有无上同样做了相关研究，利用高分辨率溶解曲线分析技术对有角/无角牦牛的群体的多态性位点分布情况进行检测，结果表明牦牛无角表型染色体候选区长度为147 kb，包含C1H21orf62、GCFC1 和SYNJ1，不同于其他牛品种的无角位点的位置，推测牦牛无角突变与其他品种不同。

牛除了有角表型和无角表型外，还有一种介于有角表型和无角表型之间的突变类型，俗称畸角(Scurs)，于1936年首先发现[42]。畸角的发育部位和构成成分与正常角基本一致，不同之处在于角的形态和角的稳固性能不同，畸角稳定性差，主要原因是没有与头骨融合，直接在皮肤上生长。Capitan等[43]对夏洛莱牛的研究发现，畸形角表型的遗传方式与其它品种的遗传方式不同，畸形角性状基因受常染色体隐性遗传；发现了2型畸角性状，对57头夏洛莱牛的基因分型数据进行了全基因组连锁分析，发现在牛4号染色体上的1.7 Mb区间的TWIST1基因被认为是一个强有力的候选基因，通过对TWIST1基因的测序，鉴定出c.148_157dup (p.A56RfsX87)的突变，导致TWIST1基因完全失活，从而引起2型畸角，该研究首次报告了影响牛角发育的潜在因果突变，为了解牛角发育提供了新的见解[44]。Asai等[45]将畸形角位点定位于牛19号染色体上 BMS2142附近 (LOD=4.21)，并在随后的分析中将畸形角基因座精确定位在 BMS2142远端4 cM 处 (LOD=4.46)和IDVGA46近端6 cM处 (LOD=2.56)。与畸角位点最近的基因分别是近端和远端基因ALOX12 和MFAP4；且在加拿大肉牛的6个家系中对X染色体上的3个微卫星标记进行了基因分型，但未与畸形角性状连锁，进一步证明了该性状不存在性连锁；无角位点定位于 1 号染色体，而畸形角位点定位于19号染色体，所以这两个性状在牛科中并不连锁[45]。

2 羊 角

2.1 起源及驯化

山羊被认为是最早驯化的家畜物种之一，距今约1万年[46]，角粗大且长。不同羊品种和性别导致羊角型也不尽相同(图2)。驯化不仅是对其野性的驯服，也包括对性状的遗传改变。野生的羊角粗大坚硬，对饲养人员有着极大危害，但经过驯化后，人们对羊角性状也进行了选育提高，偏向于选择角细小甚至无角方向进行发展。羊角的形状是其身份的象征，但是羊角并非经济性状，所以在羊群中具有角型具有多态性[48]，并可以通过两性之间的拮抗选择来维持角型多态性[49]。

图2 不同羊角型图片[47]Fig.2 Horns of different sheep[47]

2.2 形态结构及发育

羊角大小不同，形态各异。在生产实践中发现有角、无角、多角、畸形角四种角的表型。同牛角结构类似，均由骨心及角质鞘构成[50]。陈潇飞等[51]以蒙古羊和阿勒泰羊作为试验对象，针对表型为两角、多角和畸形角这3种角进行形态学、X线影像拍照及组织切片分析，其中形态学解剖结果表明：正常角结构、质地、大小和骨心的发育均比畸形角好，畸形角无光泽且干瘪。X线影像拍摄结果表明：正常角、两角或多角的形状、角轮、骨心及角质外鞘都未发现突变影；而畸形角的有突变影存在，且色泽异常，有裂痕。组织切片结果表明：在横切条件下，3种表型未见明显区别，但在纵切条件下，可以明显发现畸形角的髓质不均匀，而且形状也不规则，髓腔间距变小；而正常角的髓腔均匀，间距较广，正常两角和正常多角未见明显区别。畸形角主要表现在断裂和扭曲。Hoefs等[50]在 6岁以上的Dall绵羊的公羊和母羊群体中观测到某些个体会出现角型畸变的现象，在角生长过程中，畸形角的骨心会出现停止生长，角质鞘内部出现中空结构。对野生soay羊进行研究，发现其角的形态在两种性别中具有遗传多态性，由单个常染色体基因座(角)控制。大多数雄性有较大的正常角，但少数有退化、变形的角，称为畸角；生活中均存在无角山羊和无角绵羊。性反转的山羊中多数表现为无角。大约19世纪，人们在选育无角山羊的工作中，发现品系中存在雌雄比例失衡的现象，同时间性(有两性特征)个体比例逐步上升，这种现象被称为无角间性综合症 (Polled Intersex Syndrome，PIS)[52]。山羊出现间性的主要原因是包括XY个体性反转和XX/XY嵌合体的发生。1944年，Asdell等[53]推测无角性状是由性状常染色体显性基因控制，间性性状则是由常染色体隐性基因控制，并且提出控制间性性状与角性状的基因是紧密连锁的观点。

2.3 候选基因研究现状

在山羊中，Vaiman等[54]在 1号染色体远端绘制了遗传连锁图谱，发现山羊无角与牛的无角调控区域完全不同。利用1号染色体区域周围的遗传和细胞遗传学图谱得出家养山羊无角和间性的相关联结论，以此为目的，筛选出山羊BAC文库，利用荧光原位杂交技术将BAC文库中的30个遗传标记定位在lq41-lq45范围内，最后得出山羊染色体带lq43的3q23基因是山羊无角间性综合症最可能的位置[55]。Schibler等[56]通过克隆测序和微卫星标记等手段证实了Vaiman的结论，并将山羊无角间性综合症(PIS)区域缩小至100 kb。Pailhoux等[57]研究发现，由于山羊1号染色体上有11.7kb片段的缺失，导致发生山羊无角综合症，若纯合缺失则必为间性山羊，同时还筛选出PISRT1 (PIS regulated transcript number1) 和FOXL2 (Forkhead box L2) 基因是无角间性综合症的调控基因。张宇[58]发现PISRT1基因和FOXL2基因的多态性及突变位点山羊无角间性综合症存在紧密联系，进一步研究发现FOXL2基因不仅和无角间性性状相关，同时对角芽和眼睑的发育也起调节作用[59]。Kinas等[60]通过对波尔山羊，开士米山羊和草地山羊的有角和无角个体的52 088个SNP基因型进行全基因组关联分析发现在山羊1号染色体的769 kb的区域包含了山羊无角综合症的位点，通过单倍型分析发现并非所有的间性山羊都是纯合缺失。

在绵羊中，Johnston等[61]通过野生Soay羊全基因组关联分析，确定了角的主要候选基因为RXFP2，该基因是常染色体基因，同时首次鉴定出具有相同羊角表型但不同潜在基因型的羊，同时还发现位于绵羊10号染色体29 448 537 bp的1个位点与角的表型显著相关，基于该研究，Dominik表明29 389 966 bp的一个位点与无角性状显著相关[62]，其他的研究也进一步验证该研究结果的准确[63-66]，同时还表明角的基因型不仅可能导致角类型的离散变异，而且也是角大小的数量遗传变异[67]。Wiedemar等[68]通过对绵羊10号染色体上的RXFP2基因进行测序，解析绵羊出现无角表型的机制，研究表明RXFP2基因的3'末端存在一段由插入引起的序列突变，片段长度1 833 bp，影响了RXFP2基因的转录调控，导致出现无角表型。早期的研究表明角性状是是由两个基因座位控制，当其中一个为隐形纯合时，就会出现多角。然而，Drmundsson的结论则与前人研究相悖，表明四角性状相对于两角性状表现为显性。Kijas等[69]对Jacob和Navajo-Churro绵羊进行GWAS分析，将控制绵羊生长4个角的基因组定位到绵羊2号染色体131.9～132.6 Mb的区域内，其中最显著的SNP为132568092，位于MTX2和HOXD基因上游93 kb和251 kb处，不同于10号染色体上导致无角的RXFP2基因，证实了绵羊中无角和四角表型存在独立的基因座，且区域附近的HOXD基因群很可能参与了角的发生。同时还发现导致绵羊眼睑畸形的原因很可能是角的不正常发育引起的，说明这两个性状在发育的过程中可能相互影响[69]。Lühken等[70]对RXFP2基因的3'非翻译区的1.78 kb片段多态性插入和SNPs 3'末端的研究中发现该基因的14外显子和11内含子不能认为是绵羊多角个体的唯一原因，同时也不能作为绵羊多角个体遗传状态的通用标记。Greyvenstein等[71]通过对43个Damara绵羊进行了全基因组关联分析，研究与角数量有关的606006个SNP，发现在绵羊2号染色体上有多个显著SNPs的区域，其位置不同于绵羊10号染色体上的变异，虽然突变位点没有被确定，但HOXD基因位于2号染色体的显著区域内，是导致多角表型的候选基因。Ren等[72]对24只双角和22只四角的中国地方品种泗水裘皮羊进行全基因组关联分析，通过连锁不平衡分析和基于单倍型的关联检验，将多角的QTL定位在2号染色体的132.0～133.1 Mb的区间范围内，与HOXD、EVX2和KIAA1715基因相邻，为研究不同数量的角的遗传基础提供了新的见解，并为绵羊遗传育种提供了新的资源。He等[73]对阿勒泰羊、蒙古羊和泗水裘皮羊进行全基因组关联分析，其中包括34只双角羊和32只四角羊，发现与四角表型相关的前两个显著的单核苷酸多态性 (SNPs) 均位于绵羊 2 号染色体132.6 Mb～132.7 Mb区间，均在MTX2基因和HOXD基因簇的下游。陈潇飞等通过检测位点多态性发现绵羊多角与MTX2基因有关。对正常两角、畸形角和正常多角的两两组合利用i TRAQ蛋白表达谱进行差异蛋白的筛选，结果表明不同组合之间存在差异蛋白，主要富集在细胞外基质，细胞外基质分解代谢和粘附等组织发育等过程中；同时发现角畸形发育的候选信号通路，可能是ECM受体互作、焦点粘连和PI3K-Akt通路；初步把 S100A9、S100A12、COL6A1、TNC、LAMB2、CHAD、PARVA、KRTAP6-1和ACAN确定为可能是角畸形发育的关键蛋白[51]。

3 展 望

随着生物技术的发展和测序水平的提高，人们越来越关注无角动物的培育。不仅可以减少由于争斗导致断角引起应激(损毁胴体、毛皮，影响肉质风味)，而且便于饲养管理，同时减少饲料投入成本，提高经济效益。此外，在角性状的研究中发现仍然存在一些问题：首先无角动物的系谱结构不清晰，数据结构不完整，无法对其进行数量遗传分析，角性状对其他经济性状的影响也鲜有报道，所以无法估计其遗传效应。其次角的有无虽然是质量性状，但角的遗传规律可能是受多基因影响的，其遗传机制尚不清楚。所以在实际中应根据育种需求,通过杂交和横交固定等手段分别培育无角品系和有角品系，甚至针对药用价值高、经济效益明显的可以培育多角品系，并详细记录配种和生产性能记录，为揭示角遗传规律奠定基础。此外，针对无角牛和绵羊等动物虽然定位导致其无角性状的基因，但其无角机制尚未报道，因此有必要加大成本投入，在系谱清晰、生产性能完整的基础上开展组学水平的工作，通过全基因组关联分析、转录组等手段，识别影响无角性状的标记和基因座，为无角性状的精细定位奠定基础同时为制定和优化培育无角动物的育种方案提供参考依据。