miR-137 靶向调控Wnt5a 表达对宫颈癌细胞生长的影响

高淼 刘莉 关阿娜 王俊霞

（内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院妇产科,内蒙古 包头 014030）

宫颈癌是全世界女性中最常见的妇科恶性肿瘤之一，也是导致全世界女性肿瘤相关死亡的常见恶性肿瘤〔1〕。虽然宫颈癌的筛查和早期诊断技术有所提高，但由于感染、性生活过早和人口老龄化等多种因素导致宫颈癌的发病率仍高居不下，同时宫颈癌的长期预后并未得到改善，因此宫颈癌新的治疗手段仍需不断探索〔2〕。微小RNA（miRNA）是小型非编码RNA 家族，其表达失调可改变多个细胞和生物学过程，从而通过影响肿瘤生物学的多个方面来促进人类肿瘤的发生和发展〔3〕。研究报道在已经发现的miRNA 中，miR-137 依据不同的癌症类型既表现出致癌作用，又表现出肿瘤抑制作用〔4，5〕，而在宫颈癌中miR-137 通过与GREM1 结合抑制细胞侵袭、迁移和上皮-间质转化过程〔6〕，miRNA 通过调控各种靶基因而发挥不同的作用〔7〕，而本文发现无翅和整合位点生长因子（Wnt）5a 是miR-137 的靶基因之一，Wnt5a 是调控肿瘤恶性增殖的经典信号通路Wnt/β-catenin 的重要成员之一〔8〕，其高表达促进肿瘤的恶性增殖〔9〕，因此本文研究miR-137 靶向Wnt5a 抑制宫颈癌生长的作用并对其作用机制进行了初步的探讨，为miR-137 作为宫颈癌治疗的潜在靶点提供了新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂材料 宫颈癌细胞HeLa、C33A、Caski 和永生化宫颈上皮细胞H8（ATCC，美国）；DMEM-高糖培养基、MEM 培养基、RPMI1640 培养基、DMEM-F12 培养基和胎牛血清（FBS，Gibco，美国）；反转录试剂盒逆转录试剂盒（Fermentas，美国）；RNA 提取试剂盒和qPCR 试剂盒（北京天根生化，中国）；miR-137、Wnt5a、内参U6 和GAPDH 引物（上海生工，中国）；miR-137 mimic、过表达Wnt5a 质粒、pGLO-Wnt5a-wt（野生型）和pGLO-Wnt5a-mut（突变型，上海吉凯，中国）；双荧光素酶报道基因试剂盒和蛋白裂解液（上海碧云天，中国）；CCK8 试剂（北京东仁，中国）；EdU 增殖实验试剂盒（广州奥博，中国）；Wnt5a 和β-catenin 抗体（Abcam，英国）。

1.2 细胞培养 宫颈癌细胞和永生化宫颈上皮细胞快速复苏后重悬至含有10%FBS 的基础培养基中，HeLa 细胞培养基为DMEM-高糖、C33A 细胞培养基为MEM、Caski 细胞培养基为RPMI1640，H8 细胞培养基为DMEM-F12。细胞融合度为90%时，胰酶消化后传代，取生长状态较好的细胞进行后续实验。

1.3 方法

1.3.1 qPCR 收集细胞，加入Trizol 裂解液，采用RNA 提取试剂盒和反转录试剂盒提取细胞总RNA并逆转录为cDNA。以cDNA 为模板，采用7 500 qPCR 仪进行扩增，反应条件为95℃预变性5 s，95℃变性5 s、65℃退火30 s 共40 个循环。检测各样品的循环阈值（Ct），以U6 为内参计算miR-137相对表达量，GAPDH 为内参计算Wnt5a mRNA 相对表达量，计算公式为2-ΔΔCt。miR-137 引物序列正义链:5＇-TTATTGCTTAAGAATACGCGTAG-3＇，反义链:5＇-TGGTGTCGTGGAGTCG-3＇。U6 引物序列正义链:5＇-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3＇，反义链:5＇-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3＇。Wnt5a 引物序列正义链:5＇-ATTCTTGGTGGTCGCTAGGTA-3＇，反义链:5＇-CGCCTTCTCCGATGTACTGC-3＇。GAPDH 引物序列正义链:5＇-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3＇，反义链:5＇-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3＇。

1.3.2 miR-137 靶向调控Wnt5a 的验证 TargetScan7.1 软件（http://www.targetscan.org/）预测miR-137 的靶基因。以3 000 个HeLa 细胞/孔接种到96 孔板中，分为Wnt5a-wt+NC 组、Wnt5a-wt+miR-137 mimic 组、Wnt5a-mut+NC 组和Wnt5a-mut+miR-137 mimic 组，细胞贴壁12 h 时采用脂质体2000 将各组质粒转至细胞中。收集转染48 h 的各组细胞，采用双荧光素酶报道基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.3.3 细胞分组与转染 选取miR-137 表达最低的宫颈癌细胞，以2×105个接种至6 孔板中，分为NC 组、miR-137 mimic 组和miR-137 mimic+oe-Wnt5a（过表达Wnt5a 质粒）组。细胞贴壁12 h 时采用脂质体2000 将各组质粒转至细胞中，6 h 换液。

1.3.4 CCK-8 实验 选取miR-137 表达最低的宫颈癌细胞，以2 000 个接种至96 孔板中，分为NC组、miR-137 mimic 组和miR-137 mimic+oe-Wnt5a组，每组设置6 个复孔。按上述方法进行细胞转染。转染48 h 时加入10 μl CCK8 试剂，培养箱中孵育1 h。采用全波长扫描仪检测OD 值（450 nm）。细胞增殖率=实验孔OD 值/对照孔OD 值×100%。

1.3.5 平板克隆实验 选取miR-137 表达最低的宫颈癌细胞，以400 个接种至6 孔板中，分为NC组、miR-137 mimic 组和miR-137 mimic+oe-Wnt5a组，每组设置3 个复孔。按上述方法进行细胞转染。细胞克隆团肉眼可见时终止培养，去掉培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3 次，甲醇固定，吉姆萨染色后计数。

1.3.6 EdU 实验 选取miR-137 表达最低的宫颈癌细胞，以2 000 个接种至24 孔板中，分为NC 组、miR-137 mimic 组和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组，每组设置3 个复孔。按上述方法进行细胞转染。转染48 h 后，去掉培养基，PBS 洗3 次，甲醛固定，采用EdU 试剂盒染色后计算EdU 阳性细胞率。

1.3.7 Western 印迹检测蛋白表达 收集转染48 h的各组细胞，加入蛋白裂解液，裂解后以超高速低温离心，获得全蛋白上清液，加入上样缓冲液煮沸变性后，采用凝胶电泳分离蛋白，转膜，8%的脱脂牛奶封闭聚偏氟乙烯（PVDF）膜，4℃一抗孵育过夜，室温二抗孵育1 h，电化学发光法（ECL）曝光。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0 软件进行t检验、方差分析。

2 结果

2.1 宫颈癌细胞系中miR-137 和Wnt5a 的表达 miR-137 在宫颈癌细胞中的表达均显著高于永生化宫颈上皮细胞H8，在HeLa 细胞中表达最高（P＜0.05），选择其进行后续实验。Wnt5a 在宫颈癌细胞中的表达均显著低于永生化宫颈上皮细胞H8（P＜0.05）。见表1。

表1 miR-137 和Wnt5a 在宫颈癌细胞系中的表达(,n=3)

表1 miR-137 和Wnt5a 在宫颈癌细胞系中的表达(,n=3)

与H8 组比较:1）P＜0.05

2.2 miR-137 对Wnt5a 的靶向调控作用 TargetScan7.1 软件在线预测显示Wnt5a 启动子区与miR-137 具有结合位点，见图1。双荧光素酶实验显示:与Wnt5a-wt+NC 共转染组荧元素酶活性（1.00±0.02）相比，Wnt5a-wt+miR-137 显著降低（0.42±0.11，t=8.985，P＜0.05）；而Wnt5a-mut+NC 组荧光素酶活性（0.98 ±0.02）与Wnt5a-mut +miR-137（0.96±0.05）比较，差异无统计学意义（t=0.653，P=0.549）。与NC 组Wnt5a mRNA 表 达（1.00 ±0.02）相比，miR-137 mimic 组（0.29±0.04）和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组（0.48±0.03）均显著降低，且miR-137 mimic 组显著低于miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组（均P＜0.05）。表明miR-137 靶向负调控Wnt5a。

图1 Wnt5a 启动子区与miR-137 结合位点

2.3 CCK-8 实验 与NC 组相比，miR-137 mimic组和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组细胞增殖活性显著降低（P＜0.05）。而与miR-137 mimic 组相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组细胞增殖活性显著增加（P＜0.05），见表2。表明Wnt5a 减弱miR-137 对细胞增殖活性的抑制作用。

表2 miR-137 靶向Wnt5a 对宫颈癌细胞生长的影响(,n=3)

表2 miR-137 靶向Wnt5a 对宫颈癌细胞生长的影响(,n=3)

与NC 组比较:1）P＜0.05；与miR-137 mimic 组比较:2）P＜0.05

2.4 平板克隆实验 与NC 组相比，miR-137 mimic组和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组细胞平板克隆形成能力显著降低（P＜0.05）。而与miR-137 mimic组相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组细胞平板克隆形成显著增加（P＜0.05），见表2，图2。表明Wnt5a减弱miR-137 对细胞平板克隆形成能力的抑制作用。

图2 miR-137 调控Wnt5a 抑制HeLa 细胞克隆形成能力(吉姆萨染色,×100)

2.5 EdU 实验 与NC 组相比，miR-137 mimic 组和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组细胞Edu 阳性细胞率显著降低（P＜0.05）。而与miR-137 mimic 组相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组细胞Edu 阳性细胞率显著增加（P＜0.05），见表2，图3。表明Wnt5a 减弱miR-137 对细胞增殖能力的抑制作用。

图3 免疫荧光染色观察miR-137 调控Wnt5a 降低HeLa 细胞EdU 阳性细胞率(×200)

2.6 miR-137 调控Wnt5a 对wnt/β-catenin 信号通路的影响 与NC 组相比，miR-137 mimic 组和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组细胞中Wnt5a 和β-catenin蛋白表达显著降低（P＜0.05），而与miR-137 mimic组相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 组细胞中wnt5a和β-catenin 蛋白表达显著增加（P＜0.05），见表2，图4。表明Wnt5a 减弱miR-137 对细胞Wnt/β-catenin 信号通路的抑制作用。

图4 miR-137 靶向调控Wnt5a 抑制wnt/β-catenin 信号通路的活化

3 讨论

宫颈癌的发生和发展是一个多步骤过程，由宫颈炎症发展为宫颈上皮内瘤变，最终进展为宫颈癌，其中人乳头瘤病毒是导致初始宫颈癌变的主要因素，除此慢性宫颈炎、多次分娩和吸烟等均是宫颈癌的高危因素，但是宫颈癌发病的确切机制仍不清楚〔10〕。目前宫颈癌的治疗常用手段包括手术、化疗和放射疗法，但是这些治疗策略对于晚期的宫颈癌患者的治疗疗效有限，但是宫颈癌的早期常见症状为不规则阴道流血，常常被患者忽视，导致大多数患者确诊时已处于肿瘤晚期，因此宫颈癌患者的5 年生存率仍然很低〔2〕。随着分子生物学技术的研究进展，分子靶向药物已经成为抗肿瘤治疗的研究热点，研究报道表皮生长因子受体（EGFR）特异性单克隆抗体和血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂等分子靶向药物在宫颈癌治疗的临床试验中取得了显著疗效，表明分子靶向药物治疗宫颈癌有较好的应用前景〔11〕。

miRNA 是保守非编码RNA 的重要一大类，长度只有20～22 个核苷酸，miRNA 的异常表达会影响包括细胞增殖、细胞死亡、血管生成、侵袭和迁移等生物学行为〔3〕。miRNA 的失调是宫颈癌发病进展的常见驱动力，越来越多异常的miRNA 在宫颈癌中被发现〔12〕。miR-137 是宫颈癌中新近发现的miRNA 之一，Miao 等〔6〕报道miR-137 在宫颈癌组织和细胞系中表达降低，过表达miR-137 抑制宫颈癌细胞的增殖、克隆形成能力、侵袭和转移及裸鼠的成瘤能力，其作用机制是通过与GREM1 结合抑制转化生长因子（TGF）-β/ smad 途径的激活。miRNA通过与靶基因mRNA 的3＇-UTR 发生碱基配对，导致mRNA 的稳定化并促进mRNA 的降解，每个miRNA 的靶基因存在数个至数百个〔7〕，报道miR-137在宫颈癌中通过靶向GREM1 发挥抑癌作用〔6〕，在前列腺癌中通过靶向TRIM24 抑制肿瘤细胞的增殖能力〔13〕。

Wnt5a 在人类肿瘤中为癌基因，属于分泌性糖蛋白Wnt 家族中的亚型，Wnt5a 在宫颈癌中表达增加，促进宫颈癌的增殖〔14〕，本研究发现miR-137 在宫颈癌细胞系中表达降低，wnt5a 在宫颈癌细胞系中表达增加，与已有的研究报道一致〔6，14〕。研究显示Wnt5a 既可激活依赖β-catenin 经典Wnt 信号途径，又可激活不依赖β-catenin 非经典Wnt 信号途径的关键因子〔8〕，Wnt/β-catenin 信号通路是调控恶性肿瘤增殖的重要调控途径，且宫颈癌中Wnt/β-catenin 处于高度激活状态〔15〕，本研究结果表明在宫颈癌中miR-137 靶向Wnt5a 可能通过降低Wnt/βcatenin 信号途径的活化抑制宫颈癌细胞的生长。

综上，宫颈癌细胞系中miR-137 表达降低，Wnt5a 表达增加，miR-137 靶向Wnt5a 抑制宫颈癌细胞的生长，可能通过降低Wnt/β-catenin 信号途径的活化。