中性粒细胞外诱捕网检测方法的研究进展①

马雪妮 程 龙 许慧梅 杨一蕃 张德奎（兰州大学第二医院消化内科，兰州 730030）

中性粒细胞是人外周血中最丰富的白细胞，约占白细胞总数的50%～70%，在先天免疫系统中扮演重要角色，是机体应对病原体入侵时的第一道防线，可通过吞噬作用、脱颗粒、产生活性氧等多种途径抵御外界病原体的入侵［1］。除以上方式外，作为一种有别于细胞坏死和凋亡的特殊细胞死亡程序，中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）在机体先天性免疫中同样也发挥重要作用。越来越多的证据表明，NETs在宿主稳态中发挥双重作用，既能保护宿主免受病原体的侵袭，也参与组织损伤、炎症进展、血栓形成，引起一系列病理生理学改变，导致相应自身免疫性/炎症性疾病和代谢性疾病［2-4］。因此，NETs作为机体多种自身免疫性/炎症性疾病、代谢性疾病、血栓、肿瘤等病理生理过程的重要参与者和标志物，检测其浓度具有重要的临床意义。因其组成部分的复杂性、释放类型的差异性及释放过程中的易降解性，NETs目前没有检测的金标准，本文结合国内外研究对NETs检测方法的最新进展进行综述。

1 NETs概述

1996年，TAKEI等［5］使用佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）刺激中性粒细胞时观察到，中性粒细胞的分叶核退缩、扩散，继而核膜破裂，核内成分释放到细胞质，细胞膜破裂。此过程不同于发生核固缩和细胞质空泡化的细胞凋亡，也不同于保持核膜完整性的细胞坏死。2004年，BRINKMANN等［6］将该过程中释放到胞外的纤维网状结构正式命名为NETs。随着后续研究的不断深入，NETs被认为是以DNA为骨架，其间镶嵌有组蛋白（H1、H2A、H2B、H3、H4）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、乳铁蛋白、钙卫蛋白、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、组织蛋白酶G、穿透素3（pentraxin 3，PTX3）、明胶酶、LL37、肽聚糖结合蛋白等颗粒蛋白、蛋白水解酶和抗菌肽等［7］。目前已发现，除细菌、真菌、原生动物、病毒等病原体外，一些化学或生物因素：如PMA、IL-8、TNF-α、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、活化的血小板、ROS、补体因子5a（complementary 5a，C5a）、Toll样受体、补体因子C3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、碳酸酐酶抑制剂（carbonic anhydrase inhibitor，CaI）、葡聚糖（β-glucan，BG）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GO）、过氧化氢（H2O2）等也可诱导NETs的形成［5，8-11］。

中性粒细胞形成NETs的过程称为NETosis，研究证实，不同的刺激物作用于中性粒细胞后NETs的形成方式有所不同［12］：①自杀式NETosis：作为最早发现的NETosis类型，该过程主要依赖于ROS的产生及PAD4介导的核染色体解聚，不需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine-containing aspartatespecific proteases，Caspase）的参与［13］。JORCH等［7］描述了其具体过程：中性粒细胞受PMA等刺激后通过蛋白激酶C（PKC）激活Raf/MERK/ERK信号转导通路激活烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶，进而刺激ROS产生，从而组蛋白在肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）的作用下向瓜氨酸化组蛋白转变，形成瓜氨酸化的组蛋白，其中瓜氨酸化的组蛋白H3（cit-H3）发挥重要作用，并导致核染色体的解聚（图1A）。②细胞核DNA释放式NETosis：与自杀式NETosis不同，该过程不依赖于ROS的产生和Raf/MERK/ERK信号通路的激活。Toll样受体和补体C3蛋白等可触发此种类型的NETosis，释放NETs后的中性粒细胞寿命不受影响，且细胞核膜和细胞膜的完整性不被破坏，仍具有运动、趋化、吞噬病原体的能力，此过程约持续5～60 min［7］。但该模式具体的发生机制尚不清楚（图1B）。③线粒体DNA释放式NETosis：主要由于中性粒细胞受到GM-CSF、C5a或LPS刺激形成，该过程同样依赖于ROS的产生，持续约15 min［7，12］。

图1 自杀式NETosis（A）与细胞核DNA释放式NETosis（B）Fig.1 Suicidal NETosis（A）and vital NETosis（B）

2 体外检测方法

2.1 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附（ELISA）是一种基于抗原与抗体特异性结合以及酶催化反应建立的方法，通过酶与抗体或抗原偶联形成酶偶联物，当抗原与抗体特异结合时，酶偶联物催化无色底物分子转化为易于检测的产物。通过底物信号的变化可以判断免疫反应是否发生，进而分析目标物（抗原/抗体）的浓度。为了定量测定中性粒细胞培养上清液及小鼠和人血浆中的NETs，研究者通过ELISA检测NETs的重要组分——NE、MPO及cit-H3等，从而间接地证明了NETs的存在，同时进行定量分析［14-15］。此外，作为一种新的检测方法，基于ELISA的检测原理，MPO-DNA复合物、NE-DNA复合物、组蛋白-DNA复合物同样能够在细胞培养液及小鼠和人血浆中检测到［16-17］。该方法灵敏、快速且成本低，可实现自动化，但重复性差，对自身免疫性疾病早期阶段的诊断具有一定价值。

2.2 细胞免疫荧光染色 免疫荧光技术利用了抗原与抗体高度特异性结合的原理，将某种可测定的物质偶联到抗体或抗原上，通过检测标记物的有无和含量，对样品中待检抗原或抗体进行定性、定位和定量检测。由于NETs的主要骨架是DNA，因此广泛使用嵌入性DNA染料（如DAPI、Hoechst 33342、PI、SYTOX Orange或SYTOX Green）等检测NETs。DAPI是一种常用的标记细胞核的荧光染料，其可与细胞核中的双链DNA结合，常用于标记固定细胞的细胞核。Hoechst 33342也是一种常用的标记细胞核的荧光染料，其可选择性地与细胞核中的双链DNA相结合，常用于活细胞的细胞核标记。与之相反，SYTOX Green和SYTOX Orange不能透过细胞膜，可标记细胞外DNA，其中SYTOX Orange固有荧光可忽略不计，但与双链DNA结合后荧光增强较大（约450倍）［18］。PERDOMO等［14］分别用Hoechst 33342和SYTOX Green标记总DNA及细胞外DNA，后用激光共聚焦显微镜观察，以此对NETs进行定位及相对定量检测。随着对NETs的深入研究，基于针对NET组分的抗体结合嵌入性DNA染料的技术逐渐成为定性和半定量检测NET的首选方法，如CAUDRILLIER等［19］利用PMA刺激从健康志愿者外周血分离的中性粒细胞以产生NETs，继而固定、破膜，与MPO、组蛋白、CD41抗体共同孵育，Hoechst 33342对DNA进行复染，最后荧光共聚焦显微镜观察到以上成分共定位，从而实现了在体外对NETs进行定性、定位及相对定量检测。然而，为了解决该过程极易洗掉NETs，从而影响检测的准确性这一问题，PROUST等［20］提出了一种仅需1步，无须任何清洗，通过荧光显微镜观察的方法检测NETs，该方法以GreenGloTMDNA为染料，可通过不同的激发波长来区分核DNA和细胞外DNA（即NETs）。同时，这种染色适用于贴壁和非贴壁细胞，有望实现对其他细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞和单核细胞）细胞外诱捕网的检测。此外，对于结果的解读，不同观察者间存在较大的差异，易受到主观臆测的干扰。KRAAIJ等［21］借助3D共聚焦显微镜观察NETs，并用自动图像分析技术对NETs进行定量分析来解决这一问题。

2.3 荧光光谱法SYOX染料除了可用于免疫荧光染色，同样也可通过荧光光谱法对细胞DNA进行检测，该方法同样基于NETs以DNA为骨架，与荧光显微镜相比，其主要的优势在于可以实现高通量、快速检测［22］。PicoGreen是一种超敏的核酸荧光染料，可利用细胞总DNA为100%计算释放的NETDNA的百分比，从而定量检测细胞培养上清液中的游离DNA（cf-DNA）。LI等［3］研究发现，与健康志愿者相比，UC和CD患者血浆中以cf-DNA为代表的NETs水 平 升 高。同 样，VAN AVONDT等［23］借 助PicoGreen试剂盒检测中性粒细胞培养上清液中的cf-DNA，在荧光板读数器进行读数，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。尽管这种方法具有高度的客观性和定量性，但并非所有的cf-DNA均来自NETs，因此，有研究指出，在人或实验动物外周血及细胞培养上清液中采用PicoGreen检测NETs需排除死细胞，从而增加其测定的特异性［22，24］。

2.4 流式细胞术（flowcytometry，FCM）FCM是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有高效、快速、精准、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定性和定量分析技术之一。目前，主要有两种基于FCM的方法来检测NETs，首先，针对NETs关键成分的抗体，特别是cit-H3和MPO，以及DNA染料，在缺陷性自杀式NETosis的小鼠模型中（PAD4-/-小鼠）通过与免疫荧光染色，共聚焦显微镜观察进行比较，验证了该方法的有效性［25］。总而言之，该方法可以快速、可靠地分析每个样品数千个细胞，并且可排除不同观察者造成的偏倚。由于该方法基于对cit-H3抗体的特异性染色，研究证明细菌及病原体刺激cit-H3缺陷型小鼠后，可以检测到NETs的存在，因此该种方法可能会忽略对cit-H3阴性NETs的检测［26］。第二种则是ZHAO等［27］将流式细胞术与荧光显微镜相结合定量检测NETs的形成，即所谓的高速多光谱成像流式细胞术。利用透射光（明场），侧向散射光（SSC）和细胞组分的多个荧光图像（DNA和MPO）来对核的形态进行显像（大小、质地和相对亚细胞位置）。借助这种方法可以区分细胞核释放式和自杀式NETosis。ZHARKOVA等［18］基于流式细胞术在混合细胞群对NETs进行高通量及定量检测，此方法主要通过标记SYTOX Orange、DAPI和中性粒细胞（CD66或Ly6G）来检测混合细胞群中的NETs，此方法最主要的优势在于无需对中性粒细胞进行纯化。以上技术的局限性在于将检测的重点集中在当前正在进行中的NETosis，可能会忽略已经溶解或处于NETosis晚期的细胞。以上两种基于FCM的方法均可对中性粒细胞形态进行自动、定量和快速分析，并使NETosis作为临床前及临床研究中的潜在生物标志物成为可能。

2.5 电子显微镜技术 电子显微镜技术是利用电镜的高分辨率、高放大倍率等特点来分析研究物体的组织形态、结构特征的一种方法。NETs可通过透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）进行定性检测。BRINKMANN等［6］通过以上两种技术，而IMLAU等［28］利用TEM来区分细胞坏死、细胞凋亡和NETosis之间的差异。TEM能够显示释放NETs细胞的形态，例如核膜的裂解，而SEM则能显示NETs的细微结构。当对IL-8刺激中性粒细胞进行超薄冷冻切片取样时，通过基于SEM的免疫法可以检测到与NETs相关的组蛋白和NE，同时证明了NETs并不与细胞膜结合，具有捕获病原体的能力［6］。在此后的许多研究中，由于其可视化的特性，SEM和TEM逐渐成为检测NETs的重要手段，如YIN等［29］借助SEM及共聚焦显微镜观察到PMA刺激硫化氢预先处理的中性粒细胞时，NETs的生成明显减少。然而，必须要提到的是，REMIJSEN等［30］在渗出液中利用SEM检测NETs时发现，NETs和血液中纤维蛋白之间的形态差异并不明显，需要再次通过免疫荧光显微镜对结果进行验证。

3 原位及体内检测方法

3.1 蛋白质印迹法（Western blot，WB）WB技术是通过免疫学手段，即把聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳中分离的蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，利用抗原抗体特异性结合来检测固定在支撑膜上的蛋白质，从而对靶蛋白进行定性和半定量分析的一项实验技术。DINALLO等［2］通过构建DSS诱导的小鼠实验性结肠炎模型，利用WB法检测到小鼠结肠组织中MPO、NE、cit-H3的表达量明显高于对照组。肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）能够作用于组蛋白，使其向瓜氨酸化转变，形成瓜氨酸化的组蛋白，并导致核染色体的解聚，WB法同样可以检测到结肠组织中的PAD4表达量升高，而使用选择性PAD4的抑制剂——链黑菌素（streptonigrin）能够降低PAD4的表达量，从而缓解DSS诱导的炎症反应。此外，PERDOMO等［14］在肝素诱导的血小板减少症（HIT）小鼠模型（FcγRⅡA+/hPF4+）中检测到cit-H3的存在，由此证明NETosis是肝素诱导的血小板减少症中血栓形成的主要驱动力。WB法的优点是可以从蛋白表达方面对NETs相关蛋白进行定性和半定量分析，但其缺点则在于费时，变量多，蛋白样品的制备过程易受各种因素的影响。

3.2 组织免疫荧光染色BRINKMANN［6］等首次在自发性阑尾炎组织标本中通过对NE、cit-H3、DNA共染色确定了NETs的成分。随着技术的不断发展，越来越多的体内研究通过免疫荧光技术对实验动物和人体组织中的NETs进行测定，如DINALLO等［2］在UC、CD患者和DSS诱导的小鼠实验性结肠炎组织中通过组织免疫荧光染色检测NETs。同样，鼻内滴注LPS能够诱导肺内NETs的产生，以上结果在组织免疫荧光染色后，MPO、cit-H3和DNA在肺组织内荧光共定位得以验证［31］。有趣的是，MUNOZ等［32］通过免疫荧光染色检测到胆结石患者的胆结石及胆泥中存在NETs。然而，由于其操作步骤烦琐，洗涤过程易洗掉NETs，结果解读过程中易受观察者影响等原因，其在体内检测NETs的应用受到了一定的限制。

3.3 活体成像技术 为了观察正在进行NETosis中的NETs及该过程中的影响因素，活细胞成像技术目前成为在体内检测NETs的一种重要手段。早在2006年，BUCHANAN等［33］已经通过DNA嵌入染料将组织病理学显微镜和活细胞成像进行比较，从而证明了细菌产生的DNase，NETs降解和致病性之间的相关性。后来，FUCHS等［34］利用相差、Calcein Blue（活体染料），Annexin V（死亡标记物）和组蛋白标记物，通过随时间变化的活细胞成像技术对PMA活化的中性粒细胞进行检测，由此得出的结论是，中性粒细胞释放NETs时会死于活动性细胞死亡。LU等［35］将抗磷脂综合征（APS）患者体内的中性粒细胞分离后，予以不同物质刺激2 h后，Hoechst 33342和SYTOX Green对DNA进行标记，可观察到APS患者体内NETs的生成明显增加。NETs原位检测的一种特殊情况是将实验动物处死后立即进行活细胞成像，无须固定特定的器官。37℃PBS包埋烟曲霉菌感染的肺组织，并用SYTOX染料染色后利用双光子显微镜进行实时成像，从而实现了原位实时监测NETs的形成过程［36］。

3.4 活体显微镜技术 近年来，通过活体显微镜对形成NETs的活细胞进行实时记录已成为体内检测NETs形成研究中不可或缺的一种选择。CLARK等［37］通过活体显微镜在肝窦中检测血小板活化后产生的NETs。基于活体检测技术，YIPP等［38］假设，有活性的中性粒细胞通过囊泡的形式释放NETs。为了验证这一假设，他们将体内实验与旋转盘共聚焦活体显微镜相结合，即使用金黄色葡萄球菌感染小鼠外化的皮肤，并在2 h内使用SYTOX染料监测NETs的形成过程，从而得出的结论是，形成NETs的中性粒细胞并未立即死亡，由此作者提出存在两种不同的NETs形成机制，即自杀式和细胞核释放式NETosis［7］。随着活体研究的不断深入，多光子显微镜、旋转盘共聚焦显微镜、双光子和落射荧光显微镜分别用于检测肺脏、肝叶、静脉中形成的NETs［39-41］。此外，最近的一项研究报道了一种全自动的图像处理方法，该法采用了最新提出的卷积神经网络（CNN）模型，即MaskR-CNN，基于实时成像技术并使用DNA染料对NETs进行定性及定量检测。此法的优点在于实现了高通量、客观、简单，无须特殊仪器检测，但需要大量数据对模型进行训练以满足图像处理过程［42］。

4 结语

研究表明，特定的中性粒细胞受到感染或炎症刺激后产生NETs。通常，由于显微镜技术操作烦琐、耗时，易受观察者主观影响等缺点，在一定程度上限制了其进一步的应用，而FCM的优势在于可以对选定的细胞群进行进一步分选，例如，区分细胞核释放式和自杀式NETosis的细胞。因此，将FCM与共聚焦显微镜成像技术结合已成为目前体外检测NETs的首选方法。定量体内NETs的研究尚处于初级阶段，随着活体显微镜技术的不断发展和精密仪器的综合使用，使得区分导致NETs形成不同表型的特定信号传导过程成为可能。因此，不同的活细胞成像方法与体内或原位实验相结合逐渐成为NETs在监测感染、自身免疫/炎症性疾病、肿瘤、血栓等疾病的极佳方法。然而，要完全了解NETs在生理和病理状态下的作用，还需进一步改进其定性及定量检测方法，从而实现简单、快速、低成本、高准确性、自动化检测。