趋化因子CXCL10诱导CD8+T细胞活化促进免疫治疗对HER2阳性乳腺癌的效果①

张晓俊 贾苗苗 卫丽圆 赵 蓉 高晋南（山西白求恩医院乳腺外科，太原 030032）

趋化因子是大小为8～10 kD的趋化细胞因子。根据保守位置存在的4个半胱氨酸残基，可将趋化因子分为4个亚族：CXC（α）、CC（β）、C（γ）和CX3C（δ）［1］。其受体分别为CXCR、CCR、CR和CX3CR。CXCL10为CXC亚族成员。不同细胞类型产生的IFN-γ及促炎细胞因子刺激可诱导CXCL10分泌［2-3］。CXCL10主要通过CXCR3发挥其生物学效应，为白细胞化学诱导剂，尤其是Th1淋巴细胞［4］。此外，CXCL10参与感染性疾病发生发展。外周体液中CXCL10水平升高是宿主Th1细胞介导的免疫反应标志［5］。活化的Th1淋巴细胞可引起IFN-γ和TNF-α等上调，刺激靶细胞CXCL10，使免疫级联反应持续存在。

HER2在15%～20%乳腺癌患者中过表达，HER2阳性乳腺癌细胞往往侵袭性更强，是导致HER2阳性乳腺癌患者预后较差的原因之一［6-7］。过去20年大规模临床试验显示，单克隆抗体曲妥珠单抗在晚期乳腺癌和早期乳腺癌临床治疗中均取得了巨大进展［8-9］。而其他药物，如帕妥珠单抗及曲妥珠单抗-美坦新偶联物（T-DM1）均对HER2阳性晚期乳腺癌有显著治疗效果，有助于延长患者生存时间［10］。但在各种单抗对HER2阳性乳腺癌的治疗中，有哪些因素参与其中，以及各种单抗对HER2阳性乳腺癌的治疗机制尚未完全阐明。因此，课题组初步发现，趋化因子CXCL10可通过诱导CD8+T细胞活化促进曲妥珠单抗在HER2阳性乳腺癌中的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与小鼠SKBR-3乳腺癌细胞系购自中国科学院上海生命科学研究所细胞库（购买链接：http：//www.cellbank.org.cn/index.asp）；BALB/c小鼠购自南京大学模式生物研究所。

1.1.2 主要试剂与仪器McCoy's 5a培养基（Gibco）；胎牛血清（ExCell）；青霉素、链霉素（Solarbio）；Lipofectamine2000（Thermo Fisher）；TRIzol试剂（Qiagen）；无RNA酶水（GE）；逆转录试剂盒、Oligo dT18和SYBR Green荧光定量试剂盒（TaKaRa）；qRT-PCR所用各基因引物由华大基因合成；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司）；SDSPAGE预制胶和Western blot相关试剂（雅酶公司）；CXCL10单克隆抗体（#14969）、HER2单克隆抗体（#4290）、内参β-actin（#4970，Cell signaling technology公司）；CD8多克隆抗体（ab4055，Abcam公司）；HRP标记羊抗兔特异性二抗（AS014，Abclonal公司）；ECL显色液（Millipore公司）；HistostainTMSP-9000免疫组化染色试剂盒（Zymed公司）；紫外可见分光光度计Nanodrop 2000（Thermo Fisher）；FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 采用含10%胎牛血清的McCoy's 5a培养基培养SKBR-3乳腺癌细胞系（37℃、5%CO2）。采用慢病毒载体构建HER2过表达的SKBR-3稳定转染细胞系，pMD2.g HER2过表达质粒和psPAX2按1∶3∶3转染，按照Lipofecta mine2000说明书转染。

1.2.2 趋化因子CXCL10转基因BALB/c小鼠制备 将PMSG注射至雌性小鼠（5 U/只），2 d后注射HCG（5 U/只）。随后将雌雄小鼠合笼，分离含阴道栓的雌性小鼠。取若干只小鼠处死，取出输卵管，采用0.1%透明质酸酶和胚胎体外操作液HKSOM处理并清洗小鼠输卵管，置于胚胎体外培养液KSOM中备用。用注射针吸入线性化的含CXCL10基因的质粒，采用持卵针固定受精卵，采用注射针将质粒打入受精卵的雄原核内，直至雄原核肉眼可见地增大。将性成熟的母鼠与结扎的公鼠合笼，腹腔注射戊巴比妥溶液（10 mg/ml，0.01 mg/g）。受体母鼠麻醉后，75%乙醇彻底消毒手术部位，于小鼠背部第一根肋骨下方剪1个小口，将输卵管和子宫拉出体外，在子宫上扎1个小口，将注射有CXCL10基因的受精卵连同培养基等注射至输卵管伞部，将子宫和输卵管放回腹腔并缝合。另一侧输卵管采用相同方法处理。放回鼠笼，20 d后收集鼠崽。

1.2.3 qRT-PCR实验 收集各组细胞样品，采用TRIzol法裂解细胞，提取细胞和组织样本总RNA，提取步骤参照产品说明书。紫外可见分光光度计检测RNA质量和浓度。根据RNA浓度，取1μg RNA进行逆转录，逆转录反应体系和程序参照产品说明书。逆转录得到的cDNA采用RNase free water稀释10倍，作为模板进行qRT-PCR检测，按照SYBR Green荧光定量试剂盒说明操作，引物序列见表1。

表1 引物序列Fig.1 Primers sequence

1.2.4 Western blot采用RIPA处理细胞，4℃孵育30 min，收集细胞裂解液至1.5 ml EP管，12 000 g、4℃离心15 min，收集上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。向细胞裂解液中加入蛋白loading buffer煮沸5 min，进行10%SDS-PAGE电泳，将20 mg蛋白样品电转至PVDF膜（0.3 A，20 V），5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入TBST稀释的CXCL10兔抗（1∶2 000）或HER2兔抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的鼠抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜6次，ECL显色液显影，凝胶图像分析软件Image J分析各条带灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度值比值，实验重复3次。

1.2.5 免疫组织化学实验 从处死的移植瘤小鼠中取肿瘤组织及淋巴结组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，常规脱蜡处理。采用SP法常规操作，微波加热修复抗原，沸腾后停止加热5 min，重复加热1次，冷却至常温。PBS冲洗切片，滴加正常山羊血清封闭液封闭。HistostainTMSP-9000免疫组化染色试剂盒染色，按试剂盒说明书操作。染色后采用CXCL10兔抗（1∶100）4℃处理过夜，复温，PBS冲洗，滴加羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，滴加辣根标记工作液孵育，DAB显色5～10 min，镜下调整染色时间，苏木精复染1 min，树胶封片，拷片，拍照保存。

1.2.6 流式细胞术 收集、清洗细胞，冰冷PBS、10%FCS、1%叠氮化钠调节细胞悬液浓度至（1～5）×106个/ml，添加0.1～10μg/ml偶联的CD8一抗4℃避光培养30 min，清洗3次，400 g离心5 min，重悬于500μl～1 ml冰冷PBS、10%FCS及1%叠氮化钠中，避光冰上保存，立即采用FACSCalibur流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 趋化因子CXCL10转基因BALB/c小鼠鉴定PCR结果显示，CXCL10在BALB/c小鼠中成功表达（图1A）。Western blot证实CXCL10成功过表达（图1B）。qRT-PCR和免疫组化实验进一步显示，CXCL10成功过表达（图1C、D）。证实CXCL10过表达的BALB/c小鼠模型构建成功，可用于后续实验。

图1 趋化因子CXCL10过表达BALB/c小鼠鉴定（×200）Fig.1 Identification of chemokine CXCL10 overexpression BALB/c mice（×200）

2.2 HER2阳性SKBR-3乳腺癌细胞模型鉴定qRT-PCR实验证实，HER2成功过表达（图2A）。Western blot结果与qRT-PCR一致，HER2成功过表达（图2B）。证实HER2过表达的SKBR-3乳腺癌细胞模型构建成功，可用于后续实验。

图2 HER2阳性SKBR-3乳腺癌细胞模型鉴定Fig.2 Identification of of HER2-positive SKBR-3 breast cancer cells model

2.3 趋化因子CXCL10诱导CD8+T细胞活化 流式细胞术检测小鼠外周血中各种细胞分布情况（图3A），过表达CXCL10，CD8+T细胞比例升高，提示HER2阳性乳腺癌小鼠模型中CD8+T细胞受CXCL10过表达 的活化（图3B、C）。但CXCL10在HER2阳性乳腺癌模型中如何诱导CD8+T细胞活化有待进一步研究。

图3 趋化因子CXCL10诱导CD8+T细胞活化Fig.3 CXCL10 induces activation of CD8+T cells

2.4 趋化因子CXCL10促进HER2阳性乳腺癌免疫治疗效果 过表达CXCL10小鼠中，给予低剂量曲妥珠单抗治疗（20μg/只）可抑制HER2高表达的乳腺癌皮下肿瘤形成（图4A）。而给予PBS处理的小鼠中，皮下肿瘤大小未见明显变化。未过表达CXCL10的小鼠中，无论是否给予曲妥珠单抗治疗，皮下肿瘤大小均未见明显变化（图4A）。过表达CXCL10的小鼠中，给予低剂量曲妥珠单抗治疗可显著降低肿瘤重量和体积（图4B、C）。表明CXCL10过表达可在给予低剂量曲妥珠单抗治疗时即体现出显著抗肿瘤效果，推测CXCL10对HER2阳性乳腺癌免疫治疗的促进效果是通过CXCL10诱导CD8+T细胞活化实现的。

图4 趋化因子CXCL10促进HER2阳性乳腺癌免疫治疗效果Fig.4 CXCL10 promoting effect of immunotherapy on HER2-positive breast cancer

3 讨论

趋化因子C-X-C基序配体包括CXCL9、CXCL10、CXCL11，通常在细胞和机体稳定状态下表达较低，但可通过多种因素诱导并激活表达，如炎症、肿瘤等［11］。单核细胞、树突状细胞、内皮细胞、纤维母细胞和肿瘤细胞均可分泌CXCL9、CXCL10和CXCL11［12］。肿瘤细胞中，趋化因子分泌主要是由于细胞对Ⅰ-IFN、Ⅱ-IFN和TNF-α的反馈应答作用，通过激活转录因子STAT-1和NF-κB实现［13］。但干扰素调节因子3（IFN-regulatory factor-3，IRF-3）可通过直接与CXCL10的启动子靶向结合，促进并调控CXCL10表达，并不受I-IFN释放的影响。因此，通过细胞和机体自身的效应分子，如STING或TLR-3，IRF-3可直接诱导CXCL10转录激活［14］。

近年研究表明，趋化因子CXCL10的受体主要包括T细胞和NK细胞，并在T细胞和NK细胞的抗肿瘤反应中，通过促进药物对肿瘤的渗透以增强其对肿瘤的治疗效果［15-16］。CXCL10可被CXCR3+淋巴细胞招募，从而直接诱导黑色素瘤退化［17-18］。此外有研究报道，CXCL10可激活其受体，从而抑制内皮细胞增殖和功能，表现出强大的抗血管生成能力［19］。

CD8+T细胞通常可被肿瘤细胞消耗殆尽，但也会受抑制性受体（inhibitory receptors，IRs），如程序性细胞死亡受体（programmed cell death-1，PD-1）、T-细胞免疫球蛋白和其黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin-domain containing-3，TIM-3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、T-细胞Ig和ITIM结构域（TIGIT）及CD160和CD244等激活，从而表达升高［20-23］。这些IRs功能类似于免疫调控因子，可促进机体或细胞对抗原的耐受性。因此，CD8+T细胞通常与这些IRs共同表达。

乳腺癌的免疫治疗是一个不断发展的领域，旨在鼓励免疫系统更有效地靶向肿瘤细胞，同时也希望降低副作用，因此，乳腺癌免疫治疗方法是丰富多样的，如免疫治疗疫苗接种、免疫检查点阻断、溶瘤病毒治疗和抗肿瘤单克隆抗体［24-25］。根据免疫治疗类型，肿瘤免疫治疗可分为主动免疫和被动免疫，其中注射是主动免疫治疗最常见方法之一。乳腺癌免疫治疗面临的最大的挑战依然是肿瘤耐药性，即获得性耐药，因此乳腺癌免疫治疗初期，一般疗效较好，但一段时间后往往会复发，导致患者预后较差［26-27］。因此提高免疫治疗效果，或发展多重治疗方法，以降低肿瘤获得性耐药对治疗的影响，提高患者预后，改善患者生活质量，是目前亟需解决的问题。

本研究发现，趋化因子CXCL10可通过诱导CD8+T细胞活化，在给予低剂量曲妥珠单抗治疗时即可起显著抗肿瘤效果。本研究成功培育了CXCL10转基因的BALB/c小鼠模型，成功构建了HER2高表达的SKBR-3乳腺癌细胞模型，流式细胞实验发现，HER2阳性乳腺癌小鼠异种移植模型中，CXCL10高表达可有效诱导CD8+T细胞活化，也直接促进曲妥珠单抗的治疗效果。本结果为HER2阳性乳腺癌的免疫治疗靶点提供了初步理论依据，而具体的CXCL10诱导CD8+T活化的机制，以及CD8+T细胞在HER2阳性乳腺癌免疫治疗中的作用有待进一步研究。