HCV核心蛋白调控miR-486-5p/AKR1B10促进肝癌细胞生长的实验研究①

冯丽萍 张辉洁 欧雯婷 余 盈（广东医科大学附属医院肿瘤中心，湛江 524000）

2018年数据显示，全球因肝癌死亡人数高达78.2万，而我国占50%以上［1］。肝癌是我国癌症死亡的重要原因之一，且其发病率和死亡率持续升高，严重威胁人们身体健康和生命安全［2］。丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一种小包膜正链单股RNA病毒，其感染是除乙型肝炎病毒外诱发肝癌的另一大危险因素；HCV核心蛋白（HCV core protein，HCVc）是HCV编码的一种多功能蛋白，可通过与细胞内信号通路相互作用调控相关因子表达，影响细胞增殖和凋亡等生物学行为，导致肝癌发生［3］。因此，深入研究HCVc促进肝癌发生的分子机制对HCV感染相关性肝癌防治具有重要意义。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类非编码RNA，可通过与靶基因3'UTR特异性结合在转录后水平调控其表达发挥作用，其异常表达与HCV感染相关性肝癌发生联系密切［4］。研究指出，miR-486-5p在肝癌中异常低表达且可抑制HepG2细胞生长［5］；另外，原发性外周血单个核细胞中人类免疫缺陷病毒和HCV共同感染可引发miR-486-5p表达下调［6］；但HCV单独感染是否影响肝癌miR-486-5p表达尚未明确。研究显示，HCV感染可引起肝组织中醛酮还原家族1B10（aldehyde reductase family 1 member B10，AKR1B10）表达上调，而AKR1B10在肝癌中异常高表达，且可通过调控HepG2细胞增殖和凋亡发挥重要促癌作用［7-9］。本研究采用生物信息学软件探索miR-486-5p和AKR1B10 3'UTR的互补结合位点，推测miR-486-5p与AKR1B10的可能靶向关系，HCV感染可能通过调控肝癌中miR-486-5p/AKR1B10发挥致癌作用，因此，本研究拟通过HCVc腺病毒感染人肝癌细胞株HepG2，观察miR-486-5p和AKR1B10表达变化及两者作用关系，以期为HCV感染相关性肝癌发生机制和治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株HepG2购于宁波明舟生物科技有限公司（货号：ATCC HB-8065）；EMEM培养基购于上海子起生物科技有限公司（货号：30-2003）；胎牛血清购于上海生工生物工程股份有限公司（货号：E510002-0100）；重组腺病毒Ad-GFPHCVc（滴度为1×1011pfu/ml）和阴性对照腺病毒Ad-GFP（滴度为1×1011pfu/ml）由长沙艾碧维生物科技有限公司旗下奥诺基因合成（货号：均为HGrAd003167）；脂质体3000、Trizol试剂、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、通用RT-PCR试剂盒、MTT试剂盒和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司（货号：L3000008、15596018、D0010、RP1100、M1020-500T、CA1020-20T）；SYBR Green定量PCR试剂盒购于北京金福赛生物科技有限公司（货号：GF1051）；miR-486-5p模拟物、模拟物阴性对照miR-NC、miR-486-5p抑制剂和抑制剂阴性对照购于南通百奥迈科生物技术有限公司（货号：CS7004、CS7005、CS8004、CS8005）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与腺病毒感染 采用含10%胎牛血清的EMEM培养基常规培养HepG2细胞（37℃、5%CO2、95%相对湿度）。将长势良好的指数期HepG2细胞按1×105个/孔平铺于6孔板，常规培养贴壁，以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为20、40、60、80和100对HepG2细胞进行GFP腺病毒感染，感染48 h后采用荧光显微镜观察感染效率。

1.2.2 实验分组与处理 实验分为空白组：正常培养不进行感染；阴性对照组：感染阴性对照腺病毒Ad-GFP；HCVc组：感染重组腺病毒Ad-GFPHCVc，每组设3个重复。按1×105个/孔取指数期HepG2细胞接种至6孔板，常规培养贴壁，根据实验分组分别加入Ad-GFP、Ad-GFP-HCVc腺病毒（MOI=60）培养48 h。

1.2.3 RT-PCR检测HepG2细胞中HCVc基因表达收集处理后的3组HepG2细胞，加入1 ml Trizol试剂提取总RNA，参照RT-PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，扩增条件为：94℃6 min，94℃15 s、60℃30 s、72℃30 s，72℃5 min，38个循环。PCR扩增引物HCVc基因（长度180 bp）F：5'-CAACGCAAACCAAAATGCGA-3'，R：5'-CTTTCGGAATCGGCTGAC-3'；内参GAPDH基因（长度217 bp）F：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，R：5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。实验重复3次。

1.2.4 MTT法检测HepG2细胞增殖 将指数期HepG2细胞调整浓度为1×105个/ml，200μl/孔接种至96孔板，常规培养贴壁后，按1.2.2分组处理；分别在腺病毒感染细胞48 h、72 h和96 h时，参照MTT试剂盒说明书采用酶标仪检测HepG2细胞增殖活力，实验重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测HepG2细胞凋亡 收集腺病毒感染48 h后的3组HepG2细胞，预冷磷酸缓冲液漂洗2次，严格按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.6 qRT-PCR检测HepG2细胞miR-486-5p表达采用Trizol法提取3组HepG2细胞总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，参照SYBR Green定量PCR试剂盒说明书采用荧光定量PCR仪进行扩增，以U6为内 参，2-ΔΔCt法计 算HepG2细胞miR-486-5p表达。扩增条件为：94℃2 min，94℃10 s、60℃30 s，40个循环。PCR扩增引物序列：miR-486-5p F：5'-CATTGTGCTGTTCGTGCAGTTAA-3'，R：5'-CCCTCCAGGAATTGGCCTGTCTT-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3'。实验重复3次。

1.2.7 Western blot检 测HepG2细 胞HCVc和AKR1B10蛋白表达 收集处理后的3组HepG2细胞，加入细胞裂解液抽提总蛋白，二奎啉甲酸法对总蛋白进行定量；将蛋白样品和上样缓冲液按1∶1混合，进行SDS-PAGE电泳分离，半干法转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，转入1∶1 000稀释的一抗（HCVc、AKR1B10、GAPDH）4℃孵育过夜，转入1∶2 000稀释的二抗（辣根过氧化物酶标记）室温孵育2 h，显影；以GAPDH为内参，Quantity one软件分析HepG2细胞HCVc和AKR1B10蛋白表达。实验重复3次。

1.2.8 细胞转染 将指数期HepG2细胞平铺至6孔板，常规培养至70%融合，参照脂质体3000说明书将miR-486-5p抑制剂及其阴性对照转染至HepG2细胞，命名为anti-miR-486-5p组和anti-miRNC组，以正常培养不进行转染的HepG2细胞作为对照组，每组设3个复孔。转染48 h后收集3组细胞，RT-qPCR检测miR-486-5p表达，Western blot检测AKR1B10蛋白表达。

1.2.9 双荧光素酶报告基因实验 将含miR-486-5p和AKR1B10结合位点序列和定点突变序列克隆重组至pmirGLO载体，构建pmirGLO-AKR1B10野生型载体质粒（AKR1B10-Wt）和pmirGLO-AKR1B10突变型载体质粒（AKR1B10-Mut）；参照脂质体3000说明书将miR-486-5p模拟物、模拟物阴性对照miR-NC分别与AKR1B10-Wt、AKR1B10-Mut共转染至HepG2细胞（每组设3个复孔），转染48 h后，采用双荧光素酶报告基因实验检测各处理组细胞荧光素酶活性。实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GFP腺病毒感染效果 采用Ad-GFP腺病毒在MOI=60时感染HepG2细胞48 h，荧光显微镜观察显示感染效率达95%以上（图1A）。RT-PCR和Western blot检测结果显示，空白组和阴性对照组细胞中未见HCVc mRNA和蛋白表达，而HCVc组细胞中可见HCVc mRNA和蛋白表达（图1B、C）。

图1 腺病毒感染效果Fig.1 Adenovirus infection effect

2.2 HCVc促进肝癌HepG2细胞增殖并抑制其凋亡 腺病毒感染48 h、72 h和96 h时，阴性对照组和空白组细胞增殖活力差异无统计学意义（P＞0.05），但HCVc组细胞增殖活力明显高于阴性对照组（P＜0.05）；阴性对照组和空白组细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），但HCVc组细胞凋亡率明显低于阴性对照组（P＜0.05，图2、表1）。

表1 HCVc对HepG2细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of HCVc on proliferation and apoptosis of HepG2 cells（±s，n=9）

表1 HCVc对HepG2细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of HCVc on proliferation and apoptosis of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negative control HCVc FP OD490 48 h 0.62±0.03 0.60±0.04 0.73±0.061）21.689＜0.001 72 h 0.89±0.06 0.93±0.05 1.35±0.101）108.894＜0.001 96 h 1.19±0.13 1.22±0.15 1.68±0.151）32.903＜0.001 Apoptosis rate（%）9.52±1.16 8.75±1.23 3.02±0.211）117.323＜0.001

图2 流式细胞术检测结果Fig.2 Flow cytometry results

2.3 HCVc下调肝癌HepG2细胞miR-486-5p表达，上调AKR1B10蛋白表达 与空白组相比，阴性对照组细胞miR-486-5p和AKR1B10蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与阴性对照组相比，HCVc组细胞miR-486-5p表达明显降低，而AKR1B10蛋白表达明显升高（P＜0.05，图3、表2）。

表2 HCVc对HepG2细 胞miR-486-5p和AKR1B10蛋 白表达的影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of HCV on miR-486-5p and AKR1B10 protein expressions of HepG2 cells（±s，n=9）

表2 HCVc对HepG2细 胞miR-486-5p和AKR1B10蛋 白表达的影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of HCV on miR-486-5p and AKR1B10 protein expressions of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negative control HCVc F P miR-486-5p 1.00±0.00 0.98±0.08 0.41±0.041）378.788＜0.001 AKR1B10 protein 0.48±0.04 0.46±0.03 0.89±0.071）214.905＜0.001

图3 Western blot检测AKR1B10蛋白表达Fig.3 AKR1B10 protein expression detected by Western blot

2.4 下调miR-486-5p表达可上调HepG2细胞AKR1B10蛋白表达 与对照组相比，anti-miR-NC组细胞miR-486-5p和AKR1B10蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与anti-miR-NC组相比，antimiR-486-5p组细胞miR-486-5p表达明显降低，而AKR1B10蛋白表达明显升高（P＜0.05，图4、表3）。

表3 下调miR-486-5p表达对HepG2细胞AKR1B10蛋白表达的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-486-5p down-regulation on AKR1B10 protein expression of HepG2 cells（±s，n=9）

表3 下调miR-486-5p表达对HepG2细胞AKR1B10蛋白表达的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-486-5p down-regulation on AKR1B10 protein expression of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs anti-miR-NC group.

Groups Control anti-miR-NC anti-miR-486-5p F P miR-486-5p 1.00±0.00 0.98±0.09 0.19±0.031）640.300＜0.001 AKR1B10 protein 0.43±0.03 0.45±0.04 0.78±0.061）171.000＜0.001

图4 Western blot检测AKR1B10蛋白表达Fig.4 AKR1B10 protein expression detected by Western blot

2.5 miR-486-5p可与AKR1B10靶向结合Target-Scan软件预测结果显示，miR-486-5p和AKR1B10 3'UTR存在互补结合位点（图5）；与模拟物阴性对照miR-NC相比，共转染miR-486-5p模拟物与AKR1B10-Wt质粒细胞荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），但共转染miR-486-5p模拟物与AKR1B10-Mut质粒细胞荧光素酶活性无明显改变（P＞0.05，图6）。

图5 miR-486-5p与AKR1B10存在互补结合位点Fig.5 There were complementary binding sites between miR-486-5p and AKR1B10

图6 各组细胞荧光素酶活性Fig.6 Luciferase activity of cells in each group

3 讨论

HCVc是一种反式激活蛋白，不仅可通过影响HCV感染细胞的基因表达，还可通过形成同二聚体结构、异二聚体结构或多聚体结构干扰细胞内信号通路转导调节细胞周期、凋亡等过程，进而发挥致癌作用［10］。本研究采用HCVc重组腺病毒感染HepG2细胞，细胞增殖活力明显增强，凋亡能力明显降低，表明HCVc具有促进HepG2细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，与XU等［11］报道的HCVc可通过上调miR-196a靶向FOXO1促进HepG2细胞异常增殖的结果以及FENG等［12］报道的HCVc可通过调控sirt1-p53-bax通路抑制HepG2细胞凋亡的结果一致。

miRNAs是一类与肝癌发生密切相关的非编码RNA［13］。HCVc可通过调控部分miRNAs表达发挥致癌作用。如SHIU等［14］报道，HCVc可通过下调miR-138表达抑制肝癌细胞复制性衰老；WANG等［15］研究指出，HCVc可通过调节TGFBRAP1和HOTTIP表达影响参与调控致癌进展的miR-122和miR-204表达；HUANG等［16］发现，HCVc可通过下调miR-152表达调节Wnt1表达促进肝癌细胞异常增殖。miR-486-5p是在肝癌中异常低表达的miRNA，可通过调控相关靶基因（如PIK3R1、H3F3B、NEK2等）抑制癌细胞增殖和诱导细胞凋亡［5，17-18］；但miR-486-5p是否参与HCVc致癌机制尚未阐明。本研究进一步检测发现，HCVc重组腺病毒感染后，HepG2细胞miR-486-5p表达下调，表明HCVc可抑制HepG2细胞miR-486-5p表达。提示HCVc促进肝癌发生的分子机制可能与下调肝癌中的抑癌基因miR-486-5p表达有关。

AKR1B10是一种醛酮还原酶，不仅在调节视黄酸代谢和促进脂质合成等过程中发挥重要作用，还在包括肝癌在内的多种肿瘤细胞中发挥重要致癌作用［19-20］。本研究进一步检测发现，HCVc可上调HepG2细胞AKR1B10蛋白表达，与SATO等［21］研究所得出的HCVc可上调肝组织中AKR1B10表达结果一致。同时鉴于钱瑞坤等［8］研究证实，AKR1B10在肝癌中可通过调控HepG2细胞增殖和凋亡发挥促癌作用，提示HCVc促进肝癌发生过程中，其可能通过增强促癌因子AKR1B10表达使AKR1B10的致癌作用增强进而促进肝癌发生。本研究通过转染miR-486-5p抑制剂下调miR-486-5p表达后发现，HepG2细胞中AKR1B10蛋白表达明显升高，表明miR-486-5p低表达可促进HepG2细胞AKR1B10蛋白表达。另外，本研究通过生物信息学软件预测及双荧光素酶报告基因实验验证发现，miR-486-5p可与AKR1B10靶向结合，表明AKR1B10是miR-486-5p的潜在靶基因。提示肝癌发生过程中，低表达miR-486-5p可能通过靶向上调促癌因子AKR1B10蛋白表达发挥促癌作用。

综上所述，HCVc可引起HepG2细胞miR-486-5p表达下调和AKR1B10蛋白表达上调，AKR1B10是miR-486-5p的潜在靶基因，HCVc促进HepG2细胞增殖并抑制细胞凋亡的作用机制可能与调控miR-486-5p/AKR1B10有关。但HCVc是直接还是间接调控miR-486-5p表达有待进一步探讨。