乙型肝炎患者血清miR-27a miR-625表达及与肝硬化和肝癌的相关性研究

吴 攀， 刘成敏， 叶知瑶， 吴成凤， 徐理茂

(成都医学院第三附属医院消化内科， 四川 成都 611730)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重的公共卫生问题，在机体免疫应答的过程往往会造成肝细胞损伤和破坏，进而引起肝组织发炎，导致一系列症状和肝功能检查异常，即发生乙型肝炎[1]。HBV感染后在多种因素作用下可能逐步演进为慢性肝炎、肝硬化、肝癌。据调查，由于慢性炎症的反复发作，20%～30%的患者会发展为肝硬化或肝癌[2]。乙型肝炎给患者及社会均带来了沉重的负担，研究其发病机制具有重要价值。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年来备受关注的一类分子，广泛参与细胞生长、分化、凋亡、肿瘤发生及病毒感染发病机制等多种生命过程[3]。其中，微小RNA-27a(miR-27a)、微小RNA-625(miR-625)分别在肝癌、肝硬化中差异表达，但在乙型肝炎的表达尚不明确[4,5]。本研究将通过检测乙型肝炎患者血清miR-27a、miR-625表达水平，研究二者与肝硬化、肝癌的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2019年11月至2021年2月在成都医学院第三附属医院消化内科就诊的慢性乙型肝炎患者67例作为乙型肝炎组、乙型肝炎后肝硬化患者63例作为肝硬化组、乙型肝炎后肝癌患者65例作为肝癌组，选取同期健康体检者65例作为对照组。四组受试者性别、年龄、体质量指数(BMI)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。纳入标准：①慢性乙型肝炎诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中的相关内容[6]，年龄>40岁；②乙型肝炎后肝硬化诊断符合《肝硬化诊治指南》[7]中的相关内容，年龄>40岁；③乙型肝炎后肝癌诊断符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[8]中的相关内容，且经病理检查确诊；④临床检查资料完整者；⑤无精神疾患，可正常沟通。排除标准：①伴有其他恶性肿瘤、其他肝炎病毒感染、其他肝病、严重全身性疾病者；②近6个月内使用过干扰素、核苷酸类似物抗病毒治疗者；③近6个月内使用过激素等免疫调节剂者；④妊娠妇女。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者及其家属签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器:逆转录试剂盒(货号：AB-4366596)购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂盒(货号：SK1321)、荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green Mix)(货号：K1002S)购自美国Promega公司；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(型号：ABI 7500)购自美国Applied Biosystems公司。

表1 四组受试者一般资料比较

1.3qRT-PCR法检测血清miR-27a、miR-625表达水平

1.3.1总RNA提取:四组受试者均于清晨取空腹外周静脉血5mL，4℃ 3000r/min离心10min，分离血清。按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，加Trizol试剂，3000r/min离心10min，收集上清。用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，以260、280nm波长处RNA样本吸光度值比值处于1.8～2.0为合格。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。

1.3.2cDNA合成:使用逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录成cDNA。加1μL总RNA、1μL通用引物、9μL ddH2O于无菌Eppendof管中，置于65℃水中5min，冰上5min；依次加入5×buffer 4μL、RNA酶抑制剂1μL，10mmoL/L dNTP 2μL和逆转录酶1μL，使用DEPC水补至20μL，充分混匀后在水浴锅中42℃水浴60min，70℃水浴5min。使用qRT-PCR仪按45℃ 25min、95℃ 5min进行逆转录反应。检验合成cDNA的质量，合格后-80℃保存备用。

1.3.3qRT-PCR法检测miR-27a、miR-625水平:以U6为内参基因，采用qRT-PCR仪对miR-27a、miR-625进行扩增。miR-27a、miR-625、U6上下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，10μL反应体系：SYBR Green Mix 5μL、50 ng/μL cDNA 1 μL、10 μM上下游引物各0.5μL、ddH2O 3μL。反应条件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，40个循环终止。miR-27a上游引物：5′-GCGCTTCACAGTGGCTAAG-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-625上游引物：5′-AGGGGGAAAGTTCTATAGTCC-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；内参U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-27a、miR-625相对表达量以2-ΔΔCt法表示，Ct值为扩增产物量达到临界阈值时对应的循环数。

2 结 果

2.1四组血清miR-27a、miR-625水平:与对照组比较，乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组血清miR-27a水平显著升高，miR-625水平显著降低(P<0.05)；与乙型肝炎组比较，肝硬化组、肝癌组血清miR-27a水平显著升高，miR-625水平显著降低(P<0.05)；与肝硬化组比较，肝癌组血清miR-27a水平显著升高，miR-625水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 四组血清miR-27a miR-625水平比较

2.2影响乙型肝炎后肝硬化发生的多因素分析:将乙型肝炎后肝硬化是否发生作为因变量，以血清miR-27a、miR-625水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，血清miR-27a水平为影响乙型肝炎后肝硬化发生的独立危险因素(P<0.05)，血清miR-625水平为影响乙型肝炎后肝硬化发生的保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响乙型肝炎后肝硬化发生的多因素分析

2.3ROC曲线分析血清miR-27a、miR-625水平对乙型肝炎后肝硬化发生的预测价值:血清miR-27a水平预测乙型肝炎后肝硬化发生的曲线下面积(AUC)为0.708(95%CI：0.620～0.797)，截断值为1.24，敏感度为73.02%，特异度为61.19%，约登指数为0.342；血清miR-625水平预测乙型肝炎后肝硬化发生的AUC为0.761(95%CI：0.680～0.843)，截断值为0.80，敏感度为68.25%，特异度为73.13%，约登指数为0.414。血清miR-27a、miR-625二者联合预测乙型肝炎后肝硬化发生的AUC为0.815(95%CI：0.743～0.888)，敏感度为65.08%，特异度为85.07%，约登指数为0.502。见图1。

2.4影响乙型肝炎后肝癌发生的多因素分析:将乙型肝炎后肝癌是否发生作为因变量，以血清miR-27a、miR-625水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，血清miR-27a水平为影响乙型肝炎后肝癌发生的独立危险因素(P<0.05)，血清miR-625水平为影响乙型肝炎后肝癌发生的保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响乙型肝炎后肝癌发生的多因素分析

图1 血清miR-27a、miR-625水平单独及联合预测乙型肝炎后肝硬化发生的ROC曲线

2.5ROC曲线分析血清miR-27a、miR-625水平对乙型肝炎后肝癌发生的预测价值:血清miR-27a水平预测乙型肝炎后肝癌发生的AUC为0.870(95%CI：0.812～0.929)，截断值为1.42，敏感度为79.23%，特异度为66.57%，约登指数为0.458；血清miR-625水平预测乙型肝炎后肝癌发生的AUC为0.913(95%CI：0.864～0.963)，截断值为0.71，敏感度为76.92%，特异度为72.54%，约登指数为0.495；血清miR-27a、miR-625二者联合预测乙型肝炎后肝癌发生的AUC为0.966(95%CI：0.938～0.993)，敏感度为73.64%，特异度为89.55%，约登指数为0.632。见图2。

图2 血清miR-27a、miR-625水平单独及联合预测乙型肝炎后肝癌发生的ROC曲线

3 讨 论

HBV是一种亲肝且具有泛嗜性的DNA病毒，中国HBV表面抗原携带者占全国人口的7.18%[9]。感染HBV后，患者的肝脏经历反复损伤和修复过程，引发慢性乙型肝炎，可进一步发展为肝硬化及肝癌，严重影响患者的生命健康。而在HBV感染后的发展过程中，患者临床表现不明显，不易作出准确诊断。因此，寻找与HBV感染后发展过程有关的生物标志物，对防治乙型肝炎进一步发展恶化具有重要意义。

miRNA是一类非编码小分子单链RNA，可在转录或翻译水平上调控相关基因表达，参与肿瘤发生及病毒感染发病机制等过程。据报道，miRNA在HBV引起的肝脏慢性损伤过程中存在差异性表达，参与该进程的发生、发展，且具有更高的组织特异性和可靠性[10]。徐兰锋等[11]研究表明，血清miR-122、miR-130a水平对隐匿性乙型肝炎有重要诊断价值。miR-27a、miR-625是癌症中发挥重要作用的miRNA，在大多数癌症中差异表达，分别发挥促癌及抑癌作用。有研究表明，miR-27a在食管鳞状细胞癌中表达上调，而miR-625可抑制非小细胞肺癌的进展[12]。近年研究发现，miR-27a、miR-625在HBV感染发展中差异表达。本研究结果显示，从对照组、乙型肝炎组、肝硬化组到肝癌组，受试者血清miR-27a水平依次升高，miR-625水平依次降低，提示在乙型肝炎发生及向肝硬化、肝癌进展过程中，miR-27a、miR-625的表达受到严重影响，二者很可能参与HBV感染后乙型肝炎、肝硬化、肝癌的发生发展过程。有研究亦表明，miR-27a可促进肝癌细胞增殖[13]。而肝硬化患者miR-625表达下调，可作为肝硬化的生物标志物[5]。回归分析显示，血清miR-27a、miR-625水平分别为影响乙型肝炎后肝硬化、肝癌发生的独立危险因素和保护因素，提示血清miR-27a、miR-625水平的变化可能改变乙型肝炎发生肝硬化、肝癌的可能性，推测通过降低血清miR-27a水平、升高miR-625水平可能有助于预防乙型肝炎进展为肝硬化、肝癌。ROC曲线分析结果显示，表明血清miR-27a、miR-625对乙型肝炎后肝硬化、肝癌的发生均有一定的预测价值，二者联合预测乙型肝炎后肝硬化、肝癌发生的效果更好。

综上所述，随着乙型肝炎的发生及向肝硬化、肝癌进展，血清miR-27a、miR-625水平分别升高和降低，且两者分别为影响乙型肝炎后肝硬化、肝癌发生的独立危险因素和保护因素，对乙型肝炎后肝硬化、肝癌的发生均有一定的预测价值。本研究虽初步明确了miR-27a、miR-625与乙型肝炎进展的关系，但纳入样本量相对较少，可进一步扩大样本探讨两者在乙型肝炎预后中的作用。