无刺花椒离体培养再生体系的建立

张彩霞

（甘肃林业职业技术学院，甘肃天水 741020）

花椒属芸香科花椒属落叶小乔木，是我国主要的香料和油料作物，近年来种植效益较高，人们种植的积极性也很高［1］。但由于花椒的枝干上均密生皮刺，其采摘困难，费时费工，制约了花椒产业的发展。虽然经过多年的试验，但目前仍然未能找到很好代替人工采摘的机械或化学方法，因此，选用和种植无刺花椒是解决花椒采摘难、采摘成本高这一问题的主要途径［2］。

目前，我国无刺花椒品种资源较为丰富，有从日本引进的葡萄山椒、朝仓花椒，我国自己培育出的陇南无刺椒、农城1 号、汉源无刺花椒等［3］。这些无刺花椒品种利用实生繁殖常会发生无刺性状变异的现象［4］，因此目前普遍采用无性繁殖。植物组织培养与传统无性繁殖技术相比，能保持品种的优良性状，并且繁殖速度快、效率高，因此通过离体培养在短期内获得性状稳定的大量优良无刺花椒种苗，是促进无刺花椒发展的有效途径［5-6］。以陇南无刺花椒嫩叶为材料，研究了不同消毒剂种类和不同消毒时间对外植体消毒效果的影响和不同配方的培养基对愈伤组织诱导率及芽分化率的影响，建立了初代离体再生体系，以期为无刺花椒种苗的工厂化生产提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

陇南无刺花椒，采集于甘肃省武都区，选择具有典型性状、无病虫害的健壮无刺花椒植株，剪取当年生新梢，选取幼嫩叶片为外植体材料。试验于甘肃林业职业技术学院林木组织培养实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒处理

将选取的嫩枝剪下叶片，沿中脉将叶片剪成 1～2 cm2的小块，置于烧杯中流水冲洗60 min，然后将材料于70%的酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3～4 次，再分别用0.1% HgCl2和2% NaClO 进行消毒处理（0.1% HgCl2处理时间分别为3 min、6 min、8 min，2% NaClO处理时间分别为8 min、12 min、15 min）。最后用无菌水冲洗3～5次，然后将消毒好的嫩叶切成0.5 cm2的小块，接种在培养基中培养，接种10～15 d 后观察污染、死亡及启动情况：有菌斑出现，即统计为污染，按瓶数计算；外植体保持新鲜，没有出现变黑死亡，且10 d 后叶片周围切口出现膨大肿胀，说明成活，成活率按照成活外植体数占接种叶片总块数的百分比来计算。

1.2.2 愈伤组织诱导

以MS 培养基为基本培养基，培养基中添加蔗糖 30 g·L-1、琼脂6 g·L-1，将pH 值调至5.8～6.0。诱导外植体材料产生愈伤组织的培养基为MS+6-BA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）+2,4-D（0.1 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1），共9 个处理，每个处理20 瓶，3 次重复。15 d 后统计不同植物激素浓度配比下无刺花椒愈伤组织诱导率，用产生愈伤组织的外植体数量占培养外植体总数量的百分比表示。设置培养温度（25±1）℃，光照时间12 h·d-1，光照强度1 500～2 000 lx。

1.2.3 芽诱导

诱导外植体产生愈伤组织后，选择生长良好的愈伤组织，将其分离，转接于不同激素配比的培养基中，配方为MS+6-BA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）+NAA（0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1），诱导愈伤组织再分化产生不定芽，统计芽分化率及芽生长状况，用诱导产生芽的愈伤组织数占培养的总愈伤组织的百分比来表示。共9 个处理，每处理接种20 瓶，3 次重复。培养条件同上。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对外植体消毒效果的影响

外植体消毒接种10 d 后开始观察统计污染情况及外植体存活率，发现各处理均有不同程度的污染，污染类型多为白色、灰色霉菌污染及黏液状白色细菌污染，菌落主要在外植体边缘的培养基上，随着时间的推移菌斑会向外扩散，污染严重的会长满整个培养基表面，说明污染是由于外植体消毒不彻底造成的。2 种不同消毒剂消毒效果见表1。从表1 可以看出，0.1% HgCl2在3种不同消毒时间处理下污染率平均较2% NaClO 处理的低，成活率总体也较2% NaClO 处理的低，而且随着2% NaClO 消毒时间延长，外植体成活率没有降低。在使用0.1% HgCl2消毒的3 个处理中，消毒6 min 污染率较低，为18.3%，而外植体成活率较其他2 个处理要高，为55.3%；在使用2% NaClO 消毒的3 个处理中，消毒15 min 污染率较低，为13.3%，外植体成活率最高，为62.8%。说明陇南无刺花椒嫩叶采用70%酒精处理30 s后，再用0.1% HgCl2消毒6 min，或者用2% NaClO 消毒15 min 均能达到较好的消毒效果且能保证较高的外 植体成活率。

表1 不同消毒处理的消毒效果

2.2 不同激素浓度配比对外植体愈伤组织诱导的影响

在诱导外植体产生愈伤组织的试验中，共9 个处理，激素配比组合如表2 所示。试验结果表明，当培养基中添加6-BA 和2,4-D 浓度较低时，愈伤组织的诱导率较低，观察发现愈伤组织生长也较为缓慢，但愈伤组织的质地较好，松散且颜色呈淡黄绿色。随着培养基中6-BA和2,4-D 的浓度升高，愈伤组织诱导率有较大的提高，当6-BA 浓度为1.0 mg·L-1、2,4-D 浓度为0.3 mg·L-1和0.5 mg·L-1时，愈伤组织诱导率最高，分别为65.9%和60.6%。但当6-BA 浓度继续增加，愈伤组织诱导率开始降低，且愈伤组织质地致密；当在培养基中添加相同浓度的6-BA 时，随着2,4-D 浓度增大，愈伤组织诱导率会提高，但增加到0.5 mg·L-1时又呈下降趋势，而且部分愈伤组织出现褐化。从表2 中可以看出，培养基配方为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.3 mg·L-1愈伤组织诱导率最高，为65.9%，诱导的愈伤组织结构松散、色泽鲜艳，增殖能力强。

表2 不同激素配比对愈伤组织诱导率的影响

2.3 不同激素浓度配比对芽分化率的影响

初代培养诱导外植体产生愈伤组织，之后将生长良好的愈伤组织转入添加了不同浓度的6-BA 和NAA 的MS 培养基上进行分化诱导，统计不定芽分化率，结果见表3。从表3 可以看出，不同浓度6-BA 与NAA 组合，对无刺花椒愈伤组织诱导分化不定芽有显著的影响，随着6-BA 浓度的提高，芽分化率有所提高，但浓度过高会反而会抑制芽的分化，且随着6-BA 浓度的提高芽分化的数量增加，但由于芽的密度过大导致芽生长细弱、颜色发黄。因此适宜的浓度配比才能同时保证较高的芽分化率和芽质量。在9 个浓度配比中，当6-BA 浓度为 1.0 mg·L-1、NAA 浓度为0.3 mg·L-1时，芽分化率最高，为82.6%，并且不定芽粗壮颜色深，生长良好，其次是6-BA浓度为1.0 mg·L-1、NAA 浓度为0.2 mg·L-1时，芽分化率较高，为80.7%。因此筛选出诱导无刺花椒不定芽分化的最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。

表3 不同激素配比对芽诱导的影响

3 结论与讨论

在离体培养过程中，外植体的消毒是影响培养成功的关键因子之一，而消毒剂的选择和消毒时间的把控是外植体消毒的关键。通过2 种不同的消毒剂对无刺花椒嫩叶进行消毒处理，发现用70%酒精处理30 s 后，再用0.1% HgCl2消毒6 min，和 用2% NaClO 消毒15 min 均能达到较好的消毒效果且能保证较高的外植体成活率。HgCl2是消毒作用强且常用的一种消毒剂，但其对人体有一定危害，且容易残留在外植体材料中不容易清除［7］，对外植体材料的生活力损害较大，试验结果也表明随着HgCl2消毒时间增加，外植体的成活率会下降。而2% NaClO 随着消毒时间延长外植体成活率无明显下降，且对人体安全无毒，因此在生产和科研中可以利用NaClO替代HgCl2作为常用的消毒剂。

诱导外植体材料产生优质的愈伤组织是无刺花椒离体培养建立再生体系、进而产生完整试管苗的基础，是离体培养的重要阶段。选用MS 基本培养基加入1.0 mg·L-16-BA 和0.3 mg·L-12,4-D，对陇南无刺花椒愈伤组织诱导率最高，诱导的愈伤组织结构松散、色泽鲜艳，增殖能力强。初代培养诱导外植体产生的愈伤组织，选择生长良好的将其转入添加不同浓度的6-BA 和NAA 的培养基中诱导芽的分化，结果表明，诱导无刺花椒不定芽分化的最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1，试验结果为无刺花椒试管苗的生产奠定了基础。

目前有关无刺花椒组织培养的研究较少。以陇南无刺花椒嫩叶作为外植体，获得了较高的愈伤组织诱导和芽分化率，筛选出无刺花椒初代培养的最适培养基，建立了无菌再生体系。未来在初代培养研究的基础上，还要进一步研究继代增殖培养、生根培养技术，建立稳定的离体快繁技术体系，扩大规模，形成生产化模式，为无刺花椒良种繁育提供技术支撑。