黑田五寸胡萝卜中3个Orange基因的克隆与表达分析

王迎港 熊爱生 徐志胜

(南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)

类胡萝卜素是一类在植物质体中合成的C40类异戊二烯化合物，在自然界中分布广泛，其作为一组种类丰富的天然色素，对植物、动物和人类都有重要的作用[1-3]。在植物中，类胡萝卜素不仅参与光合作用中的光采集与光保护[4-5], 还参与花果颜色和气味的形成，有助于花粉和果实的传播[6]。在动物中，类胡萝卜素参与了鸟类和鱼类等动物鲜艳颜色物质的形成，这些颜色成为保护性色彩或参与辅助求偶，以利于动物生存和繁殖[7-8]。人体不能从头合成类胡萝卜素，需要通过摄入果蔬来补充[9]。已有研究表明，缺乏类胡萝卜素会导致夜盲症、干眼症等眼部疾病[10]。此外，摄入适量的类胡萝卜素可以降低癌症以及心血管疾病等慢性疾病的发病率[11-12]。

Orange(Or)基因编码的蛋白是一类含有类DnaJ锌指蛋白结构域的蛋白，在多种植物中高度保守[13-14]。目前，研究者们已经从花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)[13]、甘薯(Ipomoeabatatas)[15]、甜瓜(Cucumismelo)[16]和紫花苜蓿(Medicagosativa)[17]等植物中克隆获得了编码Or蛋白的基因。Or蛋白可通过转录后调节八氢番茄红素合酶(phytoene synthase, PSY)，促进类胡萝卜素合成[18]，还可以通过促进有色体隔膜的形成，促进类胡萝卜素积累[19]。Or基因的过量表达能够增加拟南芥根[18]、水稻[20]和甘薯愈伤组织[15]中类胡萝卜素的合成。

胡萝卜 (Daucuscarotassp.sativus; 2n=2x=18) 是二年生伞形科胡萝卜属植物，主要以膨大的肉质根为食用部分，因富含类胡萝卜素而具有丰富的营养价值，在世界各地广泛种植[11,21]。黑田五寸是引自日本的一个橙色胡萝卜品种，因其早熟耐热，产量稳定，营养物质丰富，在我国大陆广泛种植[22-23]。因此，以黑田五寸为材料研究胡萝卜类胡萝卜生物合成相关的Or基因，对提高胡萝卜中的类胡萝卜素含量，从而改善胡萝卜品质具有重要意义。

本研究将甜瓜中的CmOr基因(登录号：KM505046)[16]与胡萝卜的基因组[24-25]序列比对后发现3个Or基因，以胡萝卜品种黑田五寸为试验材料，克隆并获得DcOr1、DcOr2及DcOr3基因。采用生物信息学软件分析其特征，并利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测其在不同生长阶段的表达量，以期为明确胡萝卜中这3个Or基因与类胡萝卜素合成的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理

挑选饱满的黑田五寸种子于培养皿中，置于恒温培养箱催芽(条件：光/暗12/12 h，温度25℃)，种子发芽后播种于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。待植株长至30、60、90 以及120 d，分别选择长势一致的植株取根部，将材料在液氮中速冻后保存于-80℃冰箱备用。

1.2 植物总RNA的提取及cDNA合成

使用购自天根生化科技(北京)有限公司的总RNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取胡萝卜根部的总RNA和DNA。使用OneDrop OD-1000微量分光光度计(南京五义科技有限公司)测定总RNA浓度后，按照HiScriptⅡ QRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (南京诺唯赞生物公司)试剂盒说明书反转录获得cDNA。

1.3 胡萝卜DcOr基因的克隆

用BioEdit将甜瓜中的CmOr基因(登录号：KM505046)[16]与胡萝卜的基因组[24-25]比对后确定胡萝卜中的3个Or基因，使用Primer 6.0软件设计出3对引物，提交至金斯瑞生物科技有限公司进行引物合成(表1)。

表1 克隆胡萝卜3个Or基因的引物Table 1 The primers for the cloning of three Or genes in carrot

使用高保真酶Prime STAR Max，以1.2节反转录所得cDNA为模板，选择40 μL体系进行扩增。PCR反应程序为：98℃预变性10 s；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，共35个循环；72℃终延伸5 min。扩增结束后取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳确定目标产物。将目标产物连接pCAMBIA 1301载体，随后转化至大肠杆菌DH5α中，使用南京擎科生物科技有限公司2×T5 Super PCR Mix (Colony) 酶菌液检测鉴定后送至通用生物系统有限公司(安徽)进行测序。

1.4 序列分析

通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行BLAST比对得到DcOr的保守域预测，同时选取其他物种的47个Or蛋白的氨基酸序列。然后使用MEGA 5.2软件中邻接法 (neighbor-joining) 构建同源进化树，使用DNAMAN 6.0软件进行多重比较及亲水性/疏水性分析。通过BioXM 2.6软件进行氨基酸序列分析，采用ExPASy在线工具ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/) 分析理化性质。利用SignalP网站对DcOr蛋白的信号肽进行预测。采用ExPASy提供的SOPMA法 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 预测蛋白二级结构。通过WoLF PSORT在线工具 (https://wolfpsort.hgc.jp/) 预测DcOrs蛋白的亚细胞定位。

1.5 实时荧光定量PCR

使用Hieff qPCR SYBR-Green Master Mix酶(上海翊圣生物科技有限公司)按照试剂盒说明书通过IQ5实时PCR系统(Bio-Rad, 美国)进行qRT-PCR反应。以胡萝卜的DcActin1基因(登录号：XM_017371101.1)作为内参基因[26]。以1.2节所得cDNA为模板，定量检测引物列于表2。目的基因相对表达量的计算参照2-ΔΔCt法[27]。

表2 胡萝卜中3个Or基因和3个PSY基因的qRT-PCR检测引物Table 2 qRT-PCR detection primers for three Or genes and three PSY genes in carrot

1.6 总类胡萝卜素的提取及测定

参照李静文等[28]和Ma等[29]的方法，分别取30、60、90和120 d的黑田五寸胡萝卜根冻样于研钵中，加液氮研磨，然后在冷冻干燥机中冷冻抽干，每个时期称取3份样品，用丙酮提取类胡萝卜素。使用SpectraMax iD5酶标仪(Molecular Deries,美国)测定吸光值，参照田小卫[30]的方法计算总类胡萝卜素含量。

2 结果与分析

2.1 胡萝卜DcOr基因的克隆及序列分析

分别以胡萝卜黑田五寸的cDNA、DNA为模板，DcOr1-F/DcOr1-R、DcOr2-F/DcOr2-R、DcOr3-F/DcOr3-R为上/下游引物进行扩增，电泳检测分别得到一条单一的条带(图1)。测序结果表明，DcOr1含有一个933 bp 的开放阅读框 (open reading frame, ORF)，编码310个氨基酸；DcOr2的ORF长度为858 bp，编码285个氨基酸；DcOr3的ORF长度为939 bp，编码312个氨基酸。预测DcOr1相对分子量为33.81 kDa，理论等电点为5.51；DcOr2相对分子量为31.23 kDa，理论等电点为5.21；DcOr3相对分子量为34.44 kDa，理论等电点为7.93。序列分析发现，DcOr1和DcOr3均包含8个外显子和7个内含子，而DcOr2包含7个外显子和6个内含子(图2)。其中，黑田五寸胡萝卜中DcOr1和DcOr3的ORF序列及其预测的氨基酸序列与胡萝卜全基因组2.0版本(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!bulk? org=Org_Dcarota)预测的DcOr1和DcOr3序列(编号：DCAR_020166和DCAR_009172)相比一致，而DcOr2的ORF序列(NCBI登录号：MW116211)及其预测的氨基酸序列与预测的序列(编号：DCAR_009463)有一定差异(图3)，具体功能的差异有待进一步探明。

注：M：DNA分子量标准；1：DcOr1基因；2：DcOr2基因；3：DcOr3基因。Note: M: DNA marker. 1: DcOr1 gene. 2: DcOr2 gene. 3: DcOr3 gene.图1 黑田五寸胡萝卜3个Or基因的cDNA (A)和DNA (B)扩增图谱Fig.1 cDNA (A) and DNA (B) amplification of the three Or genes from Kurodagosun carrot

图2 DcOr基因外显子和内含子分布Fig.2 Schematic diagram of DcOr genes with exons and introns

注：DcOr2-Y：胡萝卜全基因组数据预测的序列；DcOr2：黑田五寸胡萝卜中实际测序结果。Note: DcOr2-Y: The predicted sequences from whole carrot genome. DcOr2: The sequences from Kurodagosun carrot.图3 黑田五寸胡萝卜中DcOr2基因的cDNA序列(A)及其预测的氨基酸序列(B)与胡萝卜全基因组预测序列的比对分析Fig.3 Comparative analysis on the DcOr2 ORF sequence (A) and its predicted amino acid sequence (B) from Kurodagosun carrot and the predicted sequences from whole carrot genome

2.2 DcOr蛋白的系统进化分析

将胡萝卜中的3个Or的氨基酸序列与其他植物的47个Or的氨基酸序列构建系统进化树(图4)，结果表明，这50种Or蛋白被分成两大分支。其中，DcOr1与DcOr2处于同一个大分支上，他们的进化关系最近，与月季Or蛋白(Rosachinensis, XP_024188987.1)表现出较近的进化关系，而DcOr3则处于另一个大分支上，其与三裂叶薯Or蛋白(Ipomoeatriloba, XP_031112030.1)进化关系最近，与苦瓜Or蛋白(Momordicacharantia, XP_022132435.1)也表现出较近的进化关系。

2.3 胡萝卜Or基因编码的氨基酸序列分析

将胡萝卜的Or氨基酸序列与甜瓜(Cucumismelo, A0A0D3MU35.1)、花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis, A2T1U1.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana, Q8VYD8.1)、番茄(Solanumlycopersicum, NP_001315338.1)、甘薯(Ipomoeabatatas, APG21184.1)、木槿(Hibiscussyriacus, KAE8735014.1)、毛棉(Gossypiumtomentosum, TYI35501.1)、苦瓜(Momordicacharantia, XP_022132435.1)、大豆(Glycinemax, XP_003540871.1)、绒毛烟草(Nicotianatomentosiformis, XP_009599295.1)、葡萄(Vitisvinifera, RVX11888.1)、落花生(Arachishypogaea, XP_025687179.1)和苹果(Malusdomestica, XP_008350183.2)的Or氨基酸序列进行比对(图5)，结果表明，DcOr基因推导的氨基酸序列包含4个高度保守的富含半胱氨酸区域(2个CxxCxGxG基序和2个CxxCxxxG基序，共包含8个半胱氨酸残基和6个甘氨酸残基)，16种Or蛋白总体相似性达70.42%，表明Or蛋白具有高度保守性。

2.4 胡萝卜Or蛋白亲水性/疏水性分析、信号肽分析、亚细胞定位和保守域预测

使用DNAMAN 6.0软件及ExPASy在线分析工具ProtParam tool对本研究中的DcOr蛋白进行亲/疏水性分析(图6)。结果表明，DcOr1是亲水性蛋白；DcOr2和DcOr3是疏水性蛋白。通过SignalP网站分析可知，DcOr1、DcOr2和DcOr3均无信号肽，属于非分泌蛋白。WoLF PSORT预测的亚细胞定位结果表明，DcOr1、DcOr2和DcOr3主要定位在质体中。保守域预测结果(图7)显示，DcOr1、DcOr2和DcOr3均属于DnaJ锌指结构域超级家族。

图6 胡萝卜3个Or蛋白的亲水性和疏水性分析Fig.6 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of the three Ors from carrot

图7 胡萝卜Or蛋白保守结构域预测Fig.7 Prediction of conserved domain of DcOr proteins

2.5 蛋白质结构分析

使用在线分析软件SOPMA对DcOr蛋白的二级结构进行预测，结果显示(图8)，DcOr1中α螺旋占32.90%，延伸链占15.48%，β转角占5.81%，无规则卷曲占45.81%；DcOr2中α螺旋占27.02%，延伸链占17.89%，β转角占4.91%，无规则卷曲占50.18%；DcOr3中α螺旋占31.09%，延伸链占20.19%，β转角占5.77%，无规则卷曲占42.95%。

注: A (1,2)、B (1,2)、C (1,2) 分别是DcOr1、DcOr2、DcOr3蛋白的二级结构预测结果。Note: A (1,2), B (1,2) and C (1,2) are the secondary structure prediction of DcOr1, DcOr2 and DcOr3 proteins, respectively.图8 3个DcOr蛋白的二级结构预测Fig.8 Secondary structure prediction of three DcOr proteins

2.6 DcOr基因和DcPSY基因在胡萝卜不同生长阶段的表达分析

前人研究表明，胡萝卜肉质根在30 d时未积累类胡萝卜素，而在60、90和120 d时则积累了大量的类胡萝卜素[31]，这与本研究测定结果(图9)一致。本研究中总类胡萝卜素测定结果表明，在30 d时的黑田五寸胡萝卜中未检测到类胡萝卜素积累，60 d时总类胡萝卜素含量达到309.94 μg·g-1DW，随后增长变缓，在90 d时积累至458.06 μg·g-1DW，120 d时总类胡萝卜素积累量达到671.82 μg·g-1DW。在黑田五寸胡萝卜定植30、60、90和120 d后, 采用qRT-PCR技术分析3个DcOr基因和3个DcPSY基因其根中的表达情况(图10)。结果发现，DcOr基因在30、60、90和120 d时均有表达，总体上看在各个阶段DcOr3表达量最高，DcOr1次之，DcOr2表达量最低(最低时为同期DcOr3表达量的0.21%，最高时为同期DcOr3表达量的11.63%)；DcOr1和DcOr2均在60 d时表达量最高，DcOr1在120 d时表达量最低，DcOr2在90 d时表达水平最低，只有DcOr2表达最高时 (60 d) 的2.24%左右；DcOr3在90 d时表达量最高，30 d时表达量最低。3个DcPSY基因中，DcPSY3基因表达量极低；DcPSY2在各个阶段表达表达量都显著高于DcPSY1和DcPSY3，从30 d到90 d呈上升趋势并在90 d时达到峰值，然后呈下降趋势；DcPSY1的相对表达量从30 d到90 d相对缓慢增长，随后呈下降趋势。

注: 不同小写字母表示在0.05 水平上差异显著。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.图9 4个生长阶段的总类胡萝卜素含量分析Fig.9 Analysis of total carotenoids content in four growth stages

图10 3个DcOr基因和3个DcPSY基因在不同生长阶段的相对表达分析Fig.10 The relative expression analysis of the three DcOr genes and three DcPSY genes at different growth stages

3 讨论

类胡萝卜素是一些植物营养和外观品质的重要组成部分[32]，在一些动植物器官中参与了黄色、橙色和红色物质的形成[7-8]。此外，类胡萝卜素对人类的身心健康也起到至关重要的作用[10-12]。PSY参与类胡萝卜素生物合成的第一步，并且是一个限速酶，而Or蛋白直接与质体中的PSY发生物理相互作用，从而对PSY进行转录后调控[18,33]。此外，Or基因的过表达可以提高类胡萝卜素水平进而提高植物对环境胁迫的耐受性[34]。所以，研究Or基因对研究类胡萝卜素生物合成具有重要意义。

本研究从胡萝卜品种黑田五寸中克隆得到3个编码Or蛋白的基因，由其推导的氨基酸序列都包含4个高度保守的区域(2个CxxCxGxG基序和2个CxxCxxxxG基序，共包含8个半胱氨酸残基和6个甘氨酸残基)，与花椰菜[13]、甘薯[15]、甜瓜[16]、紫花苜蓿[17]中的研究结果一致。花椰菜中的Or蛋白预测分子量为33.5 kDa，在进化上与拟南芥最接近[13]；甘薯(Ipomoeabatatas)IbOr蛋白预测分子量为34.3 kDa，系统进化树显示其与牵牛花的亲缘关系最近[15]；甜瓜(Cucumismelo)CmOr蛋白预测分子量为36.3 kDa，在进化上与黄瓜最接近[16]；紫花苜蓿(Medicagosativa)MsOr蛋白预测分子量为78.4 kDa，系统进化分析表明与蒺藜苜蓿亲缘关系最近[17]。而胡萝卜中DcOr1、DcOr2、DcOr3蛋白预测分子量为33.81、31.23和34.44 kDa，分别与月季和三裂叶薯最近。由此发现，Or蛋白虽然在不同植物中高度保守，但蛋白大小、亲缘关系都有一定差异。

已有研究表明，Or蛋白在花椰菜中被定位于质体和细胞核[13,35]；在甘薯中定位于细胞核和叶绿体中，且可能在热胁迫时从细胞核转移到叶绿体[15,36]；在拟南芥黄化子叶中被定位于细胞核中[37]，这与黄化子叶没有叶绿体有关。有证据表明，Or基因能促进前质体或无色质体分化为有色体，通过库的增加来促进类胡萝卜素的积累[13,38]。本研究中亚细胞定位预测结果显示DcOr1、DcOr2和 DcOr3蛋白主要存在于质体中，与前人研究结果一致。

本研究发现，随着类胡萝卜素的积累，DcOr3的相对表达量不断升高，90 d时达到峰值，而且其表达量趋势与DcPSY1、DcPSY2的相对表达量趋势相近。由此推测DcOr3表达可能与类胡萝卜素的合成最相关，后续可通过过表达及敲除基因以进一步验证DcOr3与总类胡萝卜素的积累的相关性。

值得一提的是，花椰菜中除了分离出与类胡萝卜素合成相关的Or基因外，还分离出了一个与Or基因有55%的核苷酸序列同源性的类似基因Or-like，这2个基因在功能上可能不是冗余的[13]，但具体功能未做验证。而Zhou等[18]在拟南芥的研究中发现，AtOr被敲除后AtOr-like的表达量是野生型的4.6倍，AtOr-like被敲除后AtOr的表达量是野生型的1.8倍，说明AtOr被敲除后需要更多的AtOr-like补偿；AtOr和AtOr-like在其中一个被敲除时另一个的表达量会显著提升，植株生长无明显异常，只有都被敲除时才会影响植株的正常生长。敲除结果说明AtOr和AtOr-like的功能是冗余的，正常情况下可能协同发挥作用。从图4进化树可以看出DcOr3与拟南芥AtOr-like(Arabidopsisthaliana, Q8VYD8.1)更近一些，推测胡萝卜中与类胡萝卜素合成最相关的DcOr3与AtOr-like最相似，DcOr1和DcOr2可能有功能但有待研究。这3个DcOr基因具体的作用机制有待后续试验探明。

4 结论

本研究以黑田五寸为试验材料，克隆得到了编码胡萝卜Or蛋白的DcOr1、DcOr2和DcOr3基因。进化树分析显示，在3个DcOr蛋白中，DcOr1和DcOr2在进化上更近，他们与DcOr3进化关系较远，而DcOr3同三裂叶薯Or蛋白(XP_031112030.1)进化关系较近。3个DcOr基因在胡萝卜生长的各个阶段均有表达，其中DcOr2相对表达量最低，DcOr3在各个阶段的相对表达量均最高，在90 d时达到峰值，且相对表达量趋势与DcPSY1、DcPSY2最接近，推测DcOr3与胡萝卜中类胡萝卜素的积累最相关。但3个DcOr基因具体的作用机制还有待进一步研究。