整合素β3在牦牛繁殖周期各阶段输卵管不同部位中的表达研究

2022-01-04钟董兰何翃闳潘阳阳杨珊珊王军乾余四九徐庚全

核农学报 2021年11期

钟董兰何翃闳潘阳阳杨珊珊王军乾杨贻余四九徐庚全

(甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，甘肃兰州 730070)

牦牛主要生活在海拔3000米以上的高原地区，对高寒低氧环境有很强的适应性，为促进牧民的经济和文化繁荣发挥了重要的作用[1-2]。但牦牛的繁殖率低是牧区经济发展的一大难题[3]，因此，研究牦牛生殖系统具有重要意义。输卵管是雌性生殖系统的主要组成部分，是精子储存和获能、输送卵子、受精以及早期胚胎发育等的主要场所[4-5]。根据结构和功能，输卵管分为峡部、壶腹部和漏斗部，管壁结构均包括黏膜、肌层和浆膜层[6-7]。排卵时，于输卵管峡部贮存的精子获能后缓慢向壶腹部运行；同时输卵管漏斗部是卵子捡拾的部位，通过漏斗部肌肉的收缩和输卵管伞的运动将卵子吸入输卵管，再通过纤毛细胞的摆动将卵子运送至壶腹部，从而使精子和卵子在壶腹部完成受精[8-9]。因此，输卵管对受精起着重要作用。

整合素是细胞表面受体家族成员之一，鉴于该家族对细胞和组织保持结构完整的重要性，将这些分子命名为整合素[10]。整合素主要存在于多种细胞表面，与细胞外基质结合并从中传递机械和化学信号，有助于指导受精、着床、胚胎发育、免疫应答、维持组织结构的完整性、凝血、创伤修复、肿瘤生长和转移等一系列生理和病理过程[11]。整合素家族至少由24个成员组成，是18个α和8个β亚基组合成的Ⅰ型跨膜糖蛋白[12]。根据β亚基的不同，可以将整合素分为8个亚家族，整合素β3是其中一个亚家族[13]。有研究发现，在人的妊娠早期，整合素β3在输卵管的表达水平较高，表明它对早期妊娠的维持具有重要作用[5]。Van Waes[14]和杨筱祎等[15]研究发现，在人的生殖过程中，整合素能够促进输卵管黏膜分泌营养成分、促进精子头部穿透进入卵母细胞以及促进受精卵穿透蜕膜层和胎盘滋养层。由此推测，整合素β3在输卵管中发挥着重要作用。

研究发现，整合素αv可特异性识别精氨酸-甘氨酸-冬氨酸(RGD)三肽氨基酸序列，参与细胞间的黏附，使精子和卵子在输卵管中黏附融合，从而介导受精[16]。甘肃省牛羊胚工程技术研究中心前期研究发现，整合素αv在牦牛繁殖周期各阶段输卵管不同部位中有表达并存在显著差异，主要表达于牦牛输卵管的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中，推测整合素αv在牦牛受精和早期胚胎的发育中发挥作用[17]。整合素β3和整合素αv同属于整合素家族，且整合素β3也在卵子捡拾、受精和早期胚胎发育方面发挥着重要作用，但整合素β3与牦牛输卵管相关的研究尚鲜见报道[5]。因此，本试验通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)与蛋白免疫印迹(Western-blotting, WB)检测整合素β3在牦牛繁殖周期各阶段输卵管不同部位中的表达，并通过免疫组织化学法对其进行定位，以期为进一步探索牦牛的生殖繁育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品采集在青海省西宁市百德屠宰场挑选处于繁殖周期各阶段的健康母牦牛各6头，颈动脉放血致死，分别采集卵泡期后期(卵巢上有优势卵泡，且>6 mm)，黄体期后期(卵巢上有多个黄体)同侧，妊娠期妊娠侧的输卵管，用生理盐水冲洗干净并修剪[18]。一部分用于RNA的提取，储存于-80℃超低温冰箱；另一部分用于免疫组织化学试验，将组织固定于4%的多聚甲醛溶液中。

1.1.2 主要试剂及仪器 TransZol、Evo M-MLV反转录试剂盒、Go Taq®Green Master Mix 2×(美国Promega 公司)；Taq PCR Master Mix、SYBR®Premix Ex TaqTMEraserTM(美国TaKaRa公司)；Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody、SP试剂盒、蛋白裂解液(索莱宝生物有限公司，北京)；整合素β3抗体(bs-0342R)、β-actin Antibody(亲科生物研究中心有限公司，江苏)；曝光液、DAB显色液(Beyotime 公司，上海)；荧光定量PCR仪，DP71显微照相装置(日本Olympus公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 引物的设计根据牛(Bos taurus)整合素β3基因(NM_001206490.3)和β-actin(NM_173979.3)的序列，用Primer Premier 6.0软件设计引物，于上海生工合成，β-actin基因作为内参基因。

1.2.2 RNA的提取和反转录将输卵管组织样品充分研磨，用TransZol提取总RNA，再用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，存于-20℃备用。

表1 引物序列及长度Table 1 Primer sequence and length

1.2.3 整合素β3基因在繁殖周期各阶段母牦牛输卵管不同部位中的扩增以反转录后的牦牛繁殖周期各阶段输卵管各个部位cDNA为模板，对整合素β3和β-actin进行普通PCR扩增，再将普通PCR产物用2%的琼脂凝胶进行核酸电泳。反应体系为20 μL：Taq PCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，Free Water 8 μL。整合素β3和β-actin除退火温度不同外(整合素β3 54℃和β-actin56℃)，其余反应条件一致，反应条件为：95℃预变性4 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸15 s，72℃终延伸5 min，40个循环。

1.2.4 qRT-PCR检测整合素β3基因在繁殖周期各阶段母牦牛输卵管不同部位中的表达分别将不同时期的输卵管按照峡部、壶腹部和漏斗部分为9组，每组3个复孔。反应总体系为20 μL：SYBR®Premix Ex TaqTMEraserTM10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL，无菌去离子水7.4 μL。反应条件：95℃预变性300 s，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸5 min，40个循环。每个样品重复6次。

1.2.5 蛋白样品的制备将-80℃冰箱储存的卵泡期、黄体期和妊娠期的输卵管各部位样品迅速转移到用锡箔纸包被的研钵中，加入液氮用研杵充分研磨至粉末状，各称取0.1 g至1.5 mL离心管中，并加入蛋白裂解液，冰浴摇床裂解1.5 h，存于-80℃备用。

1.2.6 WB检测整合素β3蛋白在繁殖周期各阶段母牦牛输卵管不同部位中的表达将蛋白和4×蛋白上样缓冲液按照3∶1的比例混合，进行蛋白变性，保存于-20℃。变性后的蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyarcylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳，湿转法转膜，脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4℃过夜(整合素β3抗体∶PBST=1∶400；β-actin Rabbit mAb∶PBST=1∶3 000)，二抗室温摇床40 min(Goat anti-rabbit IgG∶PBST=1∶2 000)。膜上滴加化学发光液，扫描成像仪扫描，用Image J 6.0检测灰度值，计算整合素β3蛋白的相对表达量。

1.2.7 整合素β3蛋白在繁殖周期各阶段母牦牛输卵管不同部位的免疫组化定位常规方法制作4 μm石蜡切片，下行酒精脱蜡；柠檬酸盐缓冲液抗原修复；后续按照SP试剂盒进行组织染色，其中一抗反应时，整合素β3抗体与PBS的稀释比例为1∶250；DAB显色液显色，之后苏木精染色，脱水，透明，封片，显微镜拍照观察整合素β3的表达位置。

1.3 数据分析

利用SPSS 21.0软件采用Sidak法对试验数据进行单因素方差分析，每组6次重复，结果表示为平均值±标准差。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 整合素β3基因在繁殖周期各阶段母牦牛输卵管各部位中的扩增

PCR结果显示，目的基因整合素β3和内参基因β-actin分别在198 bp和174 bp处条带单一明亮(图1)，验证反转录后的cDNA良好，可以用于后续试验。

注：M：DL2000 DNA Marker；1～3依次为卵泡期输卵管的峡部、壶腹部、漏斗部；4～6依次为黄体期输卵管的峡部、壶腹部、漏斗部；7～9依次为妊娠期输卵管的峡部、壶腹部、漏斗部。Note: M: DL2000 DNA Marker. 1-3: Fallopian tube isthmus, ampullary and infundibulum in the follicular phase. 4-6: Fallopian tube isthmus, ampullary and infundibulum in the luteal phase. 7-9: Fallopian tube isthmus, ampullary and infundibulum in the pregnancy phase.图1 β-actin 和整合素β3基因PCR产物的电泳分析Fig.1 PCR products of electrophoretic analysis of β-actin and integrin β3 gene

2.2 qRT-PCR检测整合素β3基因在繁殖周期各阶段母牦牛输卵管不同部位中的表达

由图2可知，整合素β3和β-actin基因的熔解峰相对单一，表明整合素β3和β-actin引物特异性较好。由图3可知，整合素β3基因在牦牛繁殖周期输卵管不同部位均有表达，在繁殖周期各阶段，峡部的基因表达量均显著高于壶腹部和漏斗部。在峡部中，整合素β3在妊娠期的基因表达量显著高于卵泡期和黄体期；在壶腹部和漏斗部中，卵泡期的基因表达量均显著高于黄体期和妊娠期。

图2 β-actin和整合素β3基因的熔解曲线Fig.2 Melting curve of β-actin and integrin β3 gene

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图5同。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as Fig 5.图3 整合素β3基因的相对表达量Fig.3 Relative expression of integrin β3 gene

2.3 WB检测整合素β3蛋白的相对表达量

WB结果显示，整合素β3蛋白在繁殖周期各阶段输卵管的不同部位均有表达(图4和图5)。其中在繁殖周期各阶段，整合素β3蛋白在峡部的表达量均显著高于壶腹部和漏斗部。在峡部，整合素β3蛋白在妊娠期的表达量最高，黄体期的表达量最低；在壶腹部和漏斗部，卵泡期的表达量均最高。

注：1：卵泡期输卵管峡部；2：卵泡期输卵管壶腹部；3：卵泡期输卵管漏斗部；4：黄体期输卵管峡部；5：黄体期输卵管壶腹部；6：黄体期输卵管漏斗部；7：妊娠期输卵管峡部；8：妊娠期输卵管壶腹部；9：妊娠期输卵管漏斗部。Note: 1: Fallopian tube isthmus in the follicular phase. 2: Fallopian tube ampullary in the follicular phase. 3: Fallopian tube infundibulum in the follicular phase. 4: Fallopian tube isthmus in the luteal phase. 5: Fallopian tube ampullary in the luteal phase. 6: Fallopian tube infundibulum in the luteal phase. 7: Fallopian tube isthmus in the pregnancy phase. 8: Fallopian tube ampullary in the pregnancy phase. 9: Fallopian tube infundibulum in the pregnancy phase.图4 整合素β3和β-actin蛋白的检测结果Fig.4 The Western-blotting expressions of integrin β3 and β-actin antibody

图5 整合素β3 和 β-actin 蛋白的检测结果Fig.5 Detection and analysis of integrin β3 and β-actin protein

2.4 整合素β3蛋白在繁殖周期各阶段输卵管不同部位中的分布

免疫组织化学结果显示，整合素β3蛋白主要分布于牦牛繁殖周期各阶段输卵管峡部、壶腹部和漏斗部的肌层、浆液腺、基细胞、黏膜上皮的分泌细胞、纤毛细胞中，棕褐色表示整合素β3蛋白的阳性表达产物(图6)。

注：a:卵泡期输卵管峡部；b:卵泡期输卵管壶腹部；c:卵泡期输卵管漏斗部；d:黄体期输卵管峡部；e:黄体期输卵管壶腹部；f:黄体期输卵管漏斗部；g:妊娠期输卵管峡部；h:妊娠期输卵管壶腹部；i:妊娠期输卵管漏斗部；j:输卵管峡部阴性对照；k:输卵管壶腹部阴性对照；l:输卵管漏斗部阴性对照。TM:肌层；LP:固有层；EP:黏膜上皮；P:初级皱襞；S:次级皱襞；T:三级皱襞；C:纤毛细胞；★:分泌细胞；↑:基细胞；▲:浆液腺。Note: a: Fallopian tube isthmus in the follicular phase. b: Fallopian tube ampullary in the follicular phase. c: Fallopian tube infundibulum in the follicular phase. d: Fallopian tube isthmus in the luteal phase. e: Fallopian tube ampullary in the luteal phase. f: Fallopian tube infundibulum in the luteal phase. g: Fallopian tube isthmus in the pregnancy phase. h: Fallopian tube ampullary in the pregnancy phase. i: Fallopian tube ampullary in the pregnancy phase. j: Fallopian tube isthmus negative control. k: Fallopian tube ampullary negative control. l: Fallopian tube infundibulum negative control. TM: Muscular layer. LP: Lamina propria. EP: Mucosal epithelium. P: Primary wrinkles. S: secondry wrinkles. T: Tertiary wrinkles. C: Ciliated cell.★: Secretory cell. ↑: Basal cell. ▲: Serous gland.图6 整合素β3蛋白在牦牛繁殖周期各阶段输卵管不同部位的分布Fig.6 Distribution of integrin β3 protein in different parts of the fallopian tube at reproductive stages of yak

3 讨论

整合素有两大功能，一是通过识别与结合RGD序列，参与细胞内外的双信号传导与细胞外基质的黏附；二是参与胚胎生长发育和着床、创伤修复和免疫等多种生理病理过程[19-20]。

有研究表明，整合素β3高表达于输卵管峡部黏膜上皮，可能参与精子功能的调节和授精前的修饰过程，为输卵管峡部发挥精子“储存器”的作用提供了一种分子机制。本研究中的qRT-PCR和WB结果显示，整合素β3在繁殖周期各阶段的输卵管峡部表达量均显著高于壶腹部和漏斗部。哺乳动物排卵后，精子表面的细胞外基质配体和输卵管峡部黏膜上皮高表达的整合素结合，使精子内某些蛋白激酶的酪氨酸磷酸化，激活精子进入输卵管壶腹部，与卵子结合并受精[17, 21]。因此，整合素β3在峡部的表达量高可能与储存精子，早期胚胎的运输以及发育有关。本研究中qRT-PCR和WB结果显示，整合素β3在输卵管壶腹部和漏斗部也有表达。由前人研究可知[8-9]，输卵管壶腹部是进行受精的部位，受精卵受精后进一步发育，被运输至子宫进行附植。Glander等[22]研究发现，小鼠卵母细胞可以表达多种整合素，整合素通过与精子表面的纤维粘连蛋白(fibronecein, FN)或RGD序列结合，可以调节精卵黏附，参与受精过程。同时有研究表明，整合素在生殖过程中可以介导精卵结合[22]，推测整合素β3在壶腹部的表达参与了精卵结合。哺乳动物在每个繁殖周期会排出卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex, COCs)，整合素β3可能参与输卵管上皮黏膜纤毛细胞和COCs的黏附，而这种黏附在卵子的捡拾中发挥了重要作用[23-24]。还有研究表明，COCs外延的细胞外基质内含有FN、层粘连蛋白(laminin, LM)和韧粘素-C，整合素β3可以介导细胞与FN、LM等细胞外基质的黏附[25]。因此，输卵管伞对卵子的捡拾可能是依赖漏斗部纤毛细胞的整合素β3与COCs的细胞外基质结合所完成的。

在动物体内，输卵管是精子获能、受精及胚胎早期发育的场所，输卵管上皮细胞及其分泌物对胚胎早期发育有重要作用[26]。在胚胎早期发育及运输方面，纤毛细胞和分泌细胞提供保护和营养，并参与运输[27]。在本研究中，免疫组化结果显示整合素β3在输卵管上皮细胞中有表达，与前人的研究结果一致[28]。目前已知，细胞因子、粘附分子、激素及免疫等各个方面都影响胚胎的发育和着床，其中整合素在胚胎着床、发育中发挥着至关重要的作用[29]。已知多种动物胚胎的附植受到整合素β3的调节[30-31]。Van Waes[14]和Illera[32]研究表明整合素β3参与小鼠胚胎附植过程。研究表明输卵管和配子或胚胎运动之间的适当时空协调是成功妊娠的关键，根据整合素β3在输卵管中的表达推测它可能参与了这种协调作用[33]。本研究发现，整合素β3均在牦牛繁殖周期各阶段输卵管不同部位中表达且存在表达差异，推测整合素β3与牦牛受精，精子和早期胚胎的运输、发育有关，为研究整合素β3在牦牛生殖过程中的作用提供了理论依据。