基于D-loop序列和SSR的从江田鱼与6个鲤群体的遗传分析

2022-01-04张显波傅建军胡锦丽朱文彬闵倩雯吴俣学董在杰

贵州农业科学 2021年12期

张显波，傅建军，胡锦丽，朱文彬，闵倩雯，赵飞，吴俣学，董在杰*

(1.贵州省农业科学院水产研究所，贵州贵阳 550025；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业与种质资源利用重点实验室，江苏无锡 214081)

0 引言

【研究意义】贵州山区具有悠久的稻田养鱼历史，从江田鱼是当地长期选留的地方特色品种，当地又称之为呆鲤，适宜山区、丘陵稻田养殖。从江田鱼具有肉质鲜嫩细腻，无腥味，鳞片薄，个体适中，口感好，风味佳，抗病力强等特点，深受当地养殖户和消费者喜爱。从江田鱼为贵州当地稻田的当家鱼种，养殖成本低、投入少、周期短、管理易、效益好。在贵州省黔东南州个别县份的脱贫攻坚中起到重要作用，也将在乡村振兴中扮演重要角色。从江田鱼于2020年被列入全国地理标志农产品，是从江县“稻鱼鸭系统”的重要组成部分(被联合国粮农组织列为全球重要农业文化遗产)。从江田鱼在家养条下连续传代会引起遗传多样性的丧失并导致经济下降。了解从江田鱼的遗传多样性可以为其保护策略的制定和未来育种具有重要的指导意义。【前人研究进展】通常采用分子标记评估遗传多样性，常用的方法有线粒体DNA和核微卫星(又称为简单序列重复标记，SSR)[1-5]。刘志刚等[6]研究发现，罗非鱼粤闽1号母本的F2、F4和F63个不同选育世代群体在选育过程中遗传多样性出现下降趋势，遗传分化不断加剧。黄新芯等[7]利用Illumina HiSeq TM 2500高通量测序平台对采自舟山近海的龙头鱼肌肉组织进行转录组测序发现，龙头鱼转录组SSR位点含量丰富、基元重复类型众多、重复次数较高，具有良好的分子标记开发潜力；获得的SSR标记可用于遗传多样性和系统发育关系研究。张润锋等[8]利用微卫星遗传标记研究说明三峡库区人工养殖的欧洲鳇、达氏鲟和杂交鲟具有高度遗传多态性。胡玉婷等[9]选用10个微卫星标记对9个自然群体共254尾黄颡鱼进行遗传分析结果表明，研究区域内黄颡鱼野生资源遗传多样性较高，地理群体间存在遗传分化且部分群体可能经历了瓶颈效应。郑翔等[10]利用微卫星标记对4个瓦氏黄颡鱼群体进行遗传评估，研究结果可为长江流域瓦氏黄颡鱼的保护、监测和遗传育种提供分子基础资料。王耀嵘等[11]利用MISA对金钱鱼基因组中微卫星进行筛选并分析分布特征，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳筛选高多态性位点。阮惠婷等[12-20]利用微卫星标记研究不同鱼类的遗传多样性和遗传结构。赵立祥等[21-25]结合线粒体D-loop序列和SSR标记分别对宝石鲈、笛鲷属鱼类、沿海大弹涂鱼、乌鳢及埃及品系尼罗罗非鱼种群遗传多样性进行研究。【研究切入点】目前微卫星标记已广泛用于分析包括鱼类的动物遗传多样性，将线粒体D-loop序列与微卫星标记结合分析鱼类群体遗传多样性的研究也有报道，但未见采用线粒体D-loop序列与微卫星标记结合研究从江田鱼遗传多样性的研究。【拟解决的关键问题】采用线粒体D-loop序列和微卫星分析方法，探明从江田鱼等7个鲤群体的遗传多样性，准确地了解从江田鱼群体的遗传多样性及种质资源状况，以期为其品种选育提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鲤鱼样本从江田鱼(CJTY)48尾，采自贵州省黔东南苗族自治州从江县刚边乡平正村；清水江鲤(QSJ)、太湖鲤(THL)、黄河鲤(HHL)、黑龙江鲤(HLJ)、福瑞鲤(FRL)、松浦镜鲤(SPL)的线粒体D-loop信息[26]和微卫星信息[27]源自前期研究。

1.1.2 仪器设备 NANODROP 2000分光光度仪(美国赛默飞公司)，3730XL测序分析仪(美国ABI公司)。

1.1.3 试剂 TE Buffer(pH 8.0)、无水乙醇、1%琼脂糖凝胶、PCR Master MIX，均购自北京擎科公司。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

1)基因组DNA的提取与检测。剪取实验个体的尾鳍下叶组织，无水乙醇-20℃保存。参照改良的苯酚SDS法[28]提取基因组DNA。提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，浓度及纯度由NANODROP 2000分光光度仪测定后，采用TE Buffer(pH 8.0)稀释至60 ng/μL，-20℃储存备用。

2)线粒体D-loop序列片段的扩增和测序。利用前期研究设计的引物扩增线粒体D-loop序列片段[26-27](表1)。扩增体系：25 μL PCR Master MIX、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板(60 ng/μL)2 μL、21 μL ddH2O。PCR反应程序：94℃预变性5 min；之后进行40个循环(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s)；72℃延伸10 min；4℃保存。将扩增产物送到生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

3)微卫星扩增及基因分型。结合前期研究工作[27]，从中选取11个微卫星位点(表1)进行试验，设计微卫星引物(5′端用HEX或6-FAM荧光修饰标记)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR扩增体系：10 μL PCR Master MIX、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、DNA模板(60 ng/μL)1 μL、8.2 μL ddH2O。PCR反应程序：94℃预变性5 min；之后进行32个循环(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s)；72℃延伸10 min；4℃保存。采用3730XL测序分析仪(ABI)对样品的荧光PCR产物进行毛细管扩增电泳检测，结合分子内标进行DNA片段长度计算，根据每个扩增条带分子量的差异性，判断个体各基因座的基因型。

表1 用于扩增从江田鱼D-loop序列和微卫星序列的引物信息Table 1 Primer information of D-loop sequences and microsatellite loci for amplification of Congjiang C. carpio

1.2.2 群体遗传分析使用Cluatal X比对D-loop序列测序结果，并辅以人工校对；采用MEGA 5统计序列的碱基含量。通过DNASP统计单倍型(H)，计算单倍型多样性(Hd)和核苷酸遗传多样性(π)等参数，其中，核苷酸多样性(π)和线粒体DNA的单倍型多样性(Hd)是衡量群体DNA多态程度的重要指标，其值越大，则种群或群体的遗传多样性水平越高[29-30]。微卫星分析获得微卫星位点上等位基因的条带大小后，将所得结果进行归类。采用POPGENE V1.31进行统计分析，计算各群体每个微卫星位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及遗传距离等；采用CERVUS 3.0计算多肽信息含量(PIC)；采用ARLEQUIN 3.5计算遗传分化指数(FST)，参考BALLOUX等[31]对遗传分化等级的划分依据，判定从江田鱼与其余鲤群间的分化程度：较低(00.15)遗传分化；采用MEGA6构建系统发育树，采用AMOVE进行群体分子方差分析，采用STRUCTURE分析鲤群体的遗传结构，通过假设K(群体的亚群数)为1～10，结合各K假设条件下计算的似然对数值及δK值(似然值差)，比较鲤群体的遗传相似度。

2 结果与分析

2.1 从江田鱼与6个鲤群体的线粒体DNA D-loop序列

从表2看出，7个鲤群体线粒体DNA D-loop序列中共有46个多态性位点，检测到41个单倍型。其中，从江田鱼有16个单倍型，Hap20和Hap24为其优势单倍型，分别占个体数的33.33%和20.83%。从江田鱼独立拥有的单倍型最多，为14个。D-Loop序列片段扩增、测序的结果表明，从江田鱼的单倍型数(H)和单倍型多样性指数(Hd)分别为16个和0.829，其中，Hd高于FRL和SPL，但低于其余4个鲤群体；核苷酸遗传多样性指数π为0.005，平均核苷酸差异数(G)为4.414；中性检验表明，其Tajima’s D为-0.386(P<0.05)。

表2 从江田鱼与6个鲤群体中线粒体DNA D-loop序列的单倍型分布Table 2 Haplotype distribution of mt DNA D-loop sequence in Congjiang C. carpio and 6 C. carpio Populations

2.2 从江田鱼的微卫星遗传多样性

从江田鱼的微卫星群体遗传多样性分析结果表明，等位基因数(Na)为17.45个，有效等位基因数(Ne)为9.46个，观测杂合度(Ho)为0.73；期望杂合度(He)为0.90，低于QSJ(0.93)和THL(0.92)，高于其他4个鲤群体；多态信息含量(PIC)为0.82，高于FRL(0.73)和SPL(0.50)，但低于其他4个鲤群体。从表3看出，从江田鱼与6个鲤群体的遗传变异78.49%来自于个体间，10.97%来自于群体内，10.53%来自于群体间。表明，鲤群体的遗传变异主要来自于个体间。群体间遗传分化指数(FST)为0.11，说明群体间具有中等程度的遗传分化，其中，从江田鱼与清水江鲤、太湖鲤、黄河鲤、黑龙江鲤的分化程度较低，与福瑞鲤呈中度遗传分化，从江田鱼与松浦镜鲤间呈高度遗传分化。由表4可见，从江田鱼与6个鲤群体间的遗传距离为0.466～1.161，其中，与太湖鲤的遗传距离最小，与福瑞鲤的遗传距离最大。基于Nei’s遗传距离构建UPGMA聚类树(图1)及主坐标分析PCoA结果(图2)类似，说明，从江田鱼与清水江鲤遗传差异最小，与松浦镜鲤遗传差异最大。结合各K假设的似然对数值及δK值(图3)看出，当理论群体K为3时，从江田鱼、清水江鲤、太湖鲤和黑龙江鲤群体中的个体遗传结构存在较高遗传相似度，而黄河鲤个体的遗传结构存在一定程度的混杂。从图4看出，通过基因SSR等位基因频率的群体遗传结构分析将所有样本分成3个亚群，从江田鱼、清水江鲤、黄河鲤、太湖鲤和黑龙江鲤群体中的大部分个体属亚群Ⅰ，而福瑞鲤大部分个体属亚群Ⅱ，松浦镜鲤的大部分个体属亚群Ⅲ。表明，与遗传分化指数及遗传进化树的结果均保持一致。

表3 鲤群体基于微卫星标记的分子方差分析Table 3 Analysis of molecular variance of C.carpio populations based on microsatellite markers

表4 从江田鱼与6个鲤群体间的遗传分化指数(FST)和Nei’s遗传距离(DA)Table 4 Genetic differentiation index (FST)and Nei’s genetic distance (DA)between Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations

图1 从江田鱼与6个鲤群体基于Nei’s遗传距离构建的UPGMA聚类图谱Fig.1 UPGMA dendrogram of Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations based on Nei’s genetic distance

图2 从江田鱼与6个鲤群体(A)和个体(B)基于Nei’s遗传距离的主坐标分析图谱Fig.2 Principal coordinates analysis of Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations (A)and individuals (B)

图3 基于不同K值假设的似然对数值和δK值 Fig.3 Likelihood logarithmic value and δK value based on hypothesis of different K values

注：不同颜色代表不同亚群体。Note:Different color indicates different sub-population.图4 在K=3时从江田鱼与6个鲤群体中个体的遗传结构图谱Fig.4 Genetic structure of individuals from Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations (K=3)

3 讨论

3.1 基于线粒体D-loop序列的从江田鱼群体遗传多样性

利用线粒体D-loop序列片段(932 bp)结合前期研究的6个鲤群体(清水江鲤、太湖鲤、黄河鲤、黑龙江鲤、福瑞鲤、松浦镜鲤)的D-loop序列数据[26]分析了从江田鱼的群体遗传多样性。所有群体线粒体DNA D-loop序列数据中共检测到41个单倍型，从江田鱼有16个，其中，特有的单倍型达14个。从江田鱼π值为0.005，Hd为0.829，高于福瑞鲤(932 bp)和松浦镜鲤(932 bp)，低于其余4个鲤群体[26]。说明从江田鱼群体的核苷酸多样性水平较低，而单倍型多样性水平较高。与其余6个鲤群体的研究结果相似[26]。出现此现象的原因可能与种群扩张有关[32]，种群数量急剧增加，单倍型多样性也随之增加，但核苷酸多样性却没有足够的时间得到积累[33]所致。

3.2 基于线粒体微卫星位点的从江田鱼群体遗传多样性

基于微卫星的遗传多样性研究中，可以反映遗传多样性水平的指标包括等位基因数、杂合度和多态信息含量等[34]。其中，等位基因是基础，若等位基因数目越多，则代表该群体的遗传多态性越丰富[35]。研究利用11个微卫星位点对从江田鱼进行检测，结合前期其余6个鲤群体的微卫星数据[22]，共得到338个等位基因，平均等位基因为30.73个。远大于吴明林等[36]对长江野鲤及2种养殖鲤群体的检测结果，但是低于全迎春等[37]对黑龙江鲤、散鳞镜鲤、荷包红鲤抗寒品系及松浦镜鲤4个鲤群体的研究结果。出现此结果的原因可能是由于微卫星位点的选择不同以及试验样本数量不同所致。有研究指出，即使同一个微卫星位点，如果选取的样本数量太少，也会使一些频率较低的等位基因无法被检测到[38-39]。

研究检测的11个微卫星位点的PIC为0.71～0.96，He为0.84～0.95，均>0.5，表明这些位点均为高多态性位点[40]。研究显示，从江田鱼的PIC为0.82，高于福瑞鲤(0.73)和松浦镜鲤(0.50)，而低于其余4个鲤群体，表明，此7个群体均有较高的遗传多样性。从江田鱼的期望杂合度为0.90，低于清水江鲤(0.93)和太湖鲤(0.92)，高于其余4个鲤群体[28]，进一步说明从江田鱼具有较高遗传多样性水平，且其对环境适应能力较强[18]。7个群体间遗传分化指数为0.11，群体间具有中等遗传分化水平，其中，从江田鱼与清水江鲤、太湖鲤、黄河鲤、黑龙江鲤之间的分化程度较低，与福瑞鲤之间呈中度遗传分化，从江田鱼与松浦镜鲤呈高度遗传分化。此外，对其变异来源的分析结果显示，从江田鱼的遗传变异主要来自于个体间，为进一步开展系统选育提供了丰富遗传基础。

基因SSR等位基因频率的群体遗传结构分析显示，所有样本被分成3个亚群，从江田鱼、清水江鲤、黄河鲤、太湖鲤和黑龙江鲤群体中的大部分个体属亚群Ⅰ，而福瑞鲤大部分个体属亚群Ⅱ，松浦镜鲤的大部分个体属亚群Ⅲ。与遗传分化指数及遗传进化树的结果均保持一致。基于Nei’s遗传距离构建的UPGMA聚类树与主坐标分析PCoA结果类似，表明，从江田鱼与清水江鲤遗传差异最小，与松浦镜鲤遗传差异最大。此结果也与群体间遗传分化指数的分析结果一致。研究结果可为从江田鱼的种质改良与品种选育提供依据。