微小RNA-466靶向调控Twist1影响宫颈癌SiHa细胞增殖和迁移

李莉，常春玲，魏海波

miRNA广泛存在于真核生物体内，其在进化上高度保守，miRNA的序列、数量以及功能多样，在生物体内的诸多方面均有关键调节作用［1］。miRNA不仅影响正常细胞生长过程，还与病理状态下细胞生物学特性改变有关［2］。miRNA在肿瘤中异常表达并参与调控肿瘤细胞转移和生长［3］。miR-466基因定位在3p23染色体上，其是从黑色素瘤中发现的miRNA，miR-466与乳头瘤病毒的长控制区有高度同源性，而长控制区是致癌蛋白表达的调控区域［4］。研究显示，miR-466在前列腺癌中表达下调，上调miR-466可以抑制前列腺癌细胞转移和生长［5］。后续在结直肠癌、骨肉瘤细胞中均证实miR-466具有抗肿瘤效果［6-7］。既往研究检测到宫颈癌组织中较低水平的miR-466［8］。本研究主要确定miR-466在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用与机制，为宫颈癌分子靶向治疗提供新的线索。本研究起止时间为2019年1—10月。

1 材料与方法

1.1 材料野生型（wild type，WT）和突变型（mutant，MUT）荧光素酶报告载体均由南京科佰生物科技有限公司构建；宫颈癌Caski、SiHa、C33A细胞购自上海沪震生物科技有限公司；Lipotectamine 2000和Twist1抗体购自美国Invitrogen；正常宫颈上皮End1∕E6E7细胞购自上海雅吉生物科技有限公司；波形蛋白（Vimentin）、上皮钙黏素（epithelical cadherin，E-cadherin）抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；miR-466 mimics和mimics control购自纽赫生物科技（上海）有限公司；pCDNA3.1-Twist1由上海吉玛制药技术有限公司构建。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 定量即时聚合酶链锁反应（qRT-PCR）方法测定宫颈癌细胞中miR-466表达收集宫颈癌Caski、SiHa、C33A细胞和正常宫颈上皮End1∕E6E7细胞，用Trizol试剂提取总RNA。取2 μg的RNA常规方法反转录合成cDNA。收集2 μL的cDNA配制qRTPCR反应体系，包括9 μL的SYBR Green Mix、2 μL的上下游引物，添加无RNA酶水（RNase-free H2O）至20 μL。PCR反应条件为：95℃、20 s，95℃、10 s，60℃、20 s，70℃、10 s，共40个循环。根据反应的Ct值，以U6作为内参，按照2-ΔΔCt法计算miR-466表达变 化。miR-466：正 向 引 物5，-CACTAGTGGTTCCGTTTAGTAG-3’，反 向 引 物5，-TTGTAGTCACTAGGGCACC-3’。U6引 物：正 向 引 物5，-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5，-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3 细胞转染和分组宫颈癌SiHa细胞的转染通过Lipotectamine 2000进行。将转染miR-466模拟物（miR-466 mimics）和模拟物阴性对照（mimics control）后的宫颈癌SiHa细胞命名为miR-466和miRNC组。将未处理的宫颈癌SiHa细胞标记为对照（Control）组。根据1.2中qRT-PCR方法检测转染24 h后细胞中miR-466表达。

1.4 噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖在96孔板中接种宫颈癌SiHa细胞，按照1.3中Control组、miR-NC组和miR-466组进行处理，培养24 h，加入10 μL的MTT孵育4 h。将孔内的液体吸弃，添加150 μL的二甲基亚砜溶液。酶标仪测定每个孔570 nm的吸光度。吸光度代表细胞增殖能力。

1.5 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移Transwell小室铺胶处理：用不含血清的RPMI1640将Matrigel按照5∶1的比例稀释，取80 μL添加到小室，在37℃孵育2 h。侵袭实验需在Transwell小室中铺胶，迁移实验省去该步骤，其余步骤均相同：收集Control组、miR-NC组 和miR-466组 宫颈 癌SiHa细胞，将200 μL悬浮于无血清培养液的宫颈癌SiHa细胞补充至Transwell上室，将500 μL含血清培养液加在下室，置于培养箱中培养24 h。多聚甲醛与结晶紫分别固定30 min、染色10 min。将显微镜下随机选5个视野的均值作为细胞穿膜数量。

1.6 Western blotting检测细胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表达Control、miR-NC、miR-466组细胞培养24 h，提取细胞蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳蛋白上样量为40 μg，在浓缩胶中用70 V电压电泳，在分离胶中用120 V电压电泳。在210 mA电流条件下转膜40 min。NC膜依次放在封闭液（5%牛血清白蛋白）、一抗（Vimentin、E-cadherin抗体以1∶1 000稀释）、二抗（辣根过氧化物酶标记的二抗以1∶2 000稀释）溶液中，于室温条件下反应1.5 h。ECL发光。Image J分析内参GAPDH和目的蛋白Vimentin、E-cadherin的灰度值，以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.7 miR-466靶基因预测和鉴定预测软件targetscan分析发现Twist1可能为miR-466的靶基因。将含Twist1 3，UTR端结合位点WT和MUT荧光素酶报告载体分别同miR-466 mimics和mimics control共转染到宫颈癌SiHa细胞中，48 h后，用荧光素酶活性测定试剂盒检测荧光素酶活性变化。收集培养24 h以后的Control、miR-NC、miR-466组细胞，以Western blotting方法测定Twist1蛋白表达，Twist1抗体以1∶800稀释，步骤参照1.6；以qRT-PCR方法测定Twist1 mRNA表达，结果以GAPDH作为内参，分析Twist1 mRNA水平。Twist1 mRNA：正向引物5，-CGCGAATTCGCCACCGTC-3’，反向引物5，-CCGGCGGCCGCTGGAGGACCTGGTAGAGGAA-3’。GAPDH：正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.8 pCDNA3.1-Twist1逆转miR-466作用检测在宫颈癌SiHa细胞中分别共转染Twist1过表达载体（pCDNA3.1-Twist1）与miR-466 mimics、Twist1过表达载体阴性对照（pCDNA3.1）与miR-466 mimics，命名为miR-466+pCDNA3.1-Twist1和miR-466+pCDNA3.1组。以MTT、Transwell小 室 和Western blotting方法测定细胞增殖、侵袭、迁移以及Vimentin、E-cadherin、Twist1蛋白表达，以qRT-PCR方法测定Twist1 mRNA表达，步骤同上。

1.9 统计学方法本研究所得数据均用SPSS 21.0软件分析，计量资料数据结果用±s表示，两组数据间比较用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌细胞中miR-466表达下调正常宫颈上皮End1∕E6E7细胞和宫颈癌Caski、SiHa、C33A细胞中miR-466表 达水 平依 次为：1.00±0.09、0.58±0.06、0.20±0.03、0.45±0.04。宫颈 癌Caski细胞 中miR-466表达水平低于正常宫颈上皮End1∕E6E7细胞，差异有统计学意义（t=11.65，P＜0.000 1）；宫颈癌SiHa细胞中miR-466表达水平低于正常宫颈上皮End1∕E6E7细胞，差异有统计学意义（t=25.30，P＜0.000 1）；宫颈癌C33A细胞中miR-466表达水平低于正常宫颈上皮End1∕E6E7细胞，差异有统计学意义（t=16.75，P＜0.000 1）；宫颈癌SiHa细胞中miR-466表达水平明显低于Caski细胞（t=16.99，P＜0.000 1）宫颈癌SiHa细胞中miR-466表达水平明显低于C33A细胞（t=15.00，P＜0.000 1）。miR-466在宫颈癌细胞中表达下调。

2.2 miR-466 mimics对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达影响miR-466组宫颈癌SiHa细胞中miR-466水平升高，细胞吸光度降低，细胞侵袭和迁移数目下降，Vimentin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白表达水平升高，与miR-NC组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1和表1。miR-466 mimics抑制宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移。

表1 miR-466 mimics转染后宫颈癌SiHa细胞吸光度、迁移数目、侵袭数目和Vimentin、E-cadherin蛋白以及miR-466表达水平∕±s

表1 miR-466 mimics转染后宫颈癌SiHa细胞吸光度、迁移数目、侵袭数目和Vimentin、E-cadherin蛋白以及miR-466表达水平∕±s

注：Control为空白对照，miR-NC为转染模拟物阴性对照组，miR-466为转染miR-466模拟物组，Vimentin为波形蛋白，E-cadherin为上皮钙黏蛋白，miR-466为微小ENA-466。①与miR-NC比较，P＜0.05。

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图1 Western blotting检测miR-466 mimics对宫颈癌SiHa细胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表达影响

2.3 miR-466和Twist1互为靶向关系在线靶基因软件预测到miR-466可靶向Twist1的3，UTR，见图2。

图2 miR-466和Twist1的3，UTR端结合位点示意图

宫颈癌SiHa细胞荧光素酶活性在WT和miR-466 mimics共转染组比mimics control和WT共转染组 降 低（1.00±0.11）比（0.51±0.06）。miR-466和Twist1互为靶向关系。

2.4 上调miR-466对宫颈癌SiHa细胞中Twist1表达影响Control、miR-NC、miR-466组细胞中Twist1蛋白水平依次为：0.60±0.05、0.61±0.04、0.23±0.03，Twist1 mRNA水 平 依次 为：1.00±0.09、0.99±0.10、0.32±0.04。miR-466组宫颈癌SiHa细胞中Twist1蛋白和mRNA表达水平降低，与miR-NC组比较，差异有统计学意义（蛋白：t=22.80，P＜0.000 1；mRNA：t=18.66，P＜0.000 1），见图3。上调miR-466抑制宫颈癌SiHa细胞中Twist1表达。

图3 Western blotting测定miR-466 mimics对宫颈癌SiHa细胞中Twist1蛋白表达影响

2.5 pCDNA3.1-Twist1逆转上调miR-466对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达影响与miR-466+pCDNA3.1组比较，miR-466+pCDNA3.1-Twist1组宫颈癌SiHa细胞吸光度升高，细胞迁移和侵袭数目增加，Vimentin、Twist1蛋白表达增多，Twist1 mRNA水平升高，Ecadherin蛋白表达减少（P＜0.05），见图4和表2。pCDNA3.1-Twist1逆转上调miR-466对宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移和Vimentin、E-cadherin蛋白表达影响。

表2 miR-466 mimics和pCDNA3.1-Twist1共转染后宫颈癌SiHa细胞吸光度、迁移数目、侵袭数目和Twist1、Vimentin、E-cadherin蛋白水平以及Twist1 mRNA水平∕±s

表2 miR-466 mimics和pCDNA3.1-Twist1共转染后宫颈癌SiHa细胞吸光度、迁移数目、侵袭数目和Twist1、Vimentin、E-cadherin蛋白水平以及Twist1 mRNA水平∕±s

注：Vimentin为波形蛋白，E-cadherin为上皮钙黏蛋白，Twist1为碱性螺旋-环-螺旋转录因子1，Twist1 mRNA为Twist1信使RNA，miR-466+pCDNA3.1为转染miR-466模拟物和Twist1过表达载体阴性对照，miR-466+pCDNA3.1-Twist1为转染miR-466模拟物和Twist1过表达载体。

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图4 Western blotting测定miR-466 mimics和pCDNA3.1-Twist1共转染对宫颈癌SiHa细胞中Twist1、Vimentin、E-cadherin蛋白表达影响

3 讨论

本研究表明，miR-466在正常宫颈上皮细胞中的表达水平高于宫颈癌细胞，并且上调miR-466可以抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，提示miR-466充当宫颈癌的肿瘤抑制因子发挥作用。

miRNA是一类非编码的小分子RNA，具有多种生物学功能，miRNA参与肿瘤进程，不同的miRNA在肿瘤中扮演类似癌基因或抑癌基因的作用［9-10］。现阶段已经发现多种miRNA与宫颈癌恶性生长和转移有关，这些miRNA可以作为宫颈癌进程的分子标志物和宫颈癌治疗的分子靶点［11-12］。已知miR-466靶向不同的靶基因，在结直肠癌、前列腺癌、肝癌、胃癌等肿瘤中扮演抑制作用，减弱癌细胞的生长和转移能力［5-7，13-14］。以前的研究报道证实，宫颈癌中miR-466表达下调，miR-466可能是一种抑肿瘤因子［8］。本研究证实miR-466在宫颈癌细胞生长和转移中发挥抑制作用，这与上述研究结果相符合，说明miR-466可能是宫颈癌的抑制因子。

上皮间质转化（EMT）是肿瘤细胞转移的关键步骤，高水平的EMT意味着肿瘤细胞的高转移能力［15］。细胞EMT发生时，Vimentin表达增多而Ecadherin表达减少。另外，Vimentin、E-cadherin不仅是EMT水平改变的标志蛋白，二者还是肿瘤发生过程中的癌基因和抑癌基因，Vimentin在肿瘤中过度表达而E-cadherin在肿瘤中表达下调［16］。本研究显示，miR-466可以促进宫颈癌细胞中E-cadherin蛋白表达而抑制Vimentin蛋白表达，提示miR-466抑制宫颈癌细胞EMT，这进一步证实了miR-466具有抑制宫颈癌细胞转移潜能的作用。

miRNA在不同的病理或生理进程中发挥功能是通过靶向下游靶标实现的［17］。miR-466参与肿瘤进程，在不同的肿瘤组织中的靶基因可能不同，miR-466通过靶向调控RUNX2参与前列腺癌进展，而在骨肉瘤中通过靶基因CCND1影响骨肉瘤转移［5，7］。本研究发现，miR-466可以靶向负调控宫颈癌细胞中Twist1的表达。Twist1位于常染色体上，编码碱性螺旋-环-螺旋转录因子，参与肿瘤转移、生长、耐药、血管生成过程，可能是肿瘤治疗靶点和独立预后指标［18］。目前已知，下调Twist1可以抑制宫颈癌细胞转移和增殖，Twist1在宫颈癌中高表达是宫颈癌发生和发展的重要原因［19］。本研究表明，上调Twist1可以降低miR-466对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用，miR-466在宫颈癌细胞转移中的作用机制与Twist1有关。

总之，miR-466在宫颈癌转移中可能发挥抑制作用，其可以在体外抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，作用机制与靶向下调Twist1表达有关。目前对于miR-466靶向Twist1通过何种下游调控机制影响宫颈癌进程还不明确，在以后的实验中会进行探讨。本研究为阐明宫颈癌分子发生机制提供了资料，为靶向基因治疗宫颈癌提供了理论参考。