闭塞性细支气管炎动物模型研究进展

张冰雪，宋桂华，张岩

(河南中医药大学第一附属医院 儿科，河南 郑州 450000)

闭塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans，BO)以小气道上皮细胞炎症反应及纤维化收缩，致使气道管腔狭窄或闭塞为主要病理学表现[1]，是严重的呼吸系统慢性疾病。该病可能发生于器官移植(肺移植、骨髓移植等)后，严重的感染性疾病或者在吸入有毒物质或结缔组织疾病后也可能出现[2]。其临床症状以反复的咳嗽、咯痰、持续喘息、气促或呼吸困难，运动耐力下降为主要表现。BO根据不同的病理表现类型可分为限制性细支气管炎及增殖性细支气管炎，前者以细支气管管壁周围纤维化和瘢痕收缩引起管腔扭曲和缩窄为特征性改变，后者特点是息肉状的肉芽组织阻塞气道管腔。BO病因复杂多，见于移植后、感染、有毒物质吸入、药物诱发以及结缔组织病等。遗憾的是，针对BO的治疗，尤其是对肺功能的改善尚无特效手段，BO缺乏干预和治疗策略的部分原因可归于用以研究疾病发展的动物模型的有限可用性，理想的动物模型在了解疾病的复杂病理生理学并制定新的预防和治疗策略的过程中起着至关重要的作用。目前的动物模型的构建多以气管或肺移植方法为主，除此外，以化学损伤、病毒感染等方法构建BO动物模型的方法也有报道[3-5]。本文就近年来文献中BO模型的研究进展进行简要总结，以供实验研究参考。

1 移植模型

1.1 肺移植

1.1.1原位肺移植 原位肺移植模型首次报道见于1971年[6]，此后便有学者将肺移植模型用以BO的研究，De Vleeschauwer等[7]发现，肺移植后2周表现出在血管和气道周围的急性排斥，在4～12周内，在25%～50%的小鼠中观察到BO病变，出现炎症细胞浸润、管腔狭窄或闭塞。原位肺移植模型的优势在于，该方式更接近人体的正常生理状态，是最符合BO发生机制的实验动物模型，但将该模型用于BO研究时所面临的主要挑战除急性排斥反应外，肺移植过程对操作者手术和显微外科操作技术有较高的要求，其关键和难点在于需在显微镜下分别吻合肺动脉和肺静脉。尽管有研究通过对套管吻合局部操作的改良，简化手术步骤[8]，但除外手术因素，肺移植术后受体动物的死亡率高，形成病理改变周期长等因素也限制了该造模方式的推广。

1.1.2异位肺移植 啮齿动物异位肺移植尚无成功建立BO模型的报道，尽管Hertz、Xavier-elsas等[9-10]构建小鼠异位肺移植动物模型，但是异体供肺在植入受体后短期内迅速发生坏死。Salminen等[11]进行大型动物猪的BO模型研究，将猪的终末细支气管及周围肺组织植入皮下，1～3周植物病理出现气道上皮细胞脱落、支气管管腔狭窄、管壁纤维化、软骨环变性以及单个核细胞浸润聚集等变化。该模型的优点在于手术操作简单，能够将移植物多位点植入，但缺点在于，大型动物的饲养成本高，手术复杂，故异位肺移植BO模型的实用性及可重复性不高。

1.2 气管移植

1.2.1原位气管移植 相对于原位肺移植，啮齿类动物气管原位移植模型是比较常用的BO模型之一。首个小鼠原位气管移植模型是Genden等[12]在2002公开报道，但模型建立过程需要手术显微镜，对器械及手术熟练度要求也较高。王欣等[13]改良气管移植技术，移植后直接用颈部肌肉和腺体包绕气管，简化了手术方式，并且移植后病理显示黏膜下炎症细胞浸润、气道上皮逐渐脱落坏死、气管阻塞率于15、30及60 d逐渐增加，符合闭塞性细支气管炎病理学特点。该模型被广泛用于研究上皮细胞再生过程及其在排斥反应中的保护作用，该模型手术操作过程相对简单，气管移植后病变出现早，缩短实验时间，移植物与外界空气相通。但同样存在以下缺陷：移植物未进行血管重建所用气管属于大气道，缺乏肺内微环境，并且由于移植后发生上皮细胞再生，因此不会出现明显的管腔纤维化闭塞，很难观察到典型病变。

1.2.2异位气管移植 1993年，Hertz等[9]首次建立了异位气管移植术后BO动物模型，将供体小鼠的气管植入受体小鼠的背部皮下，10 d后，移植气管出现淋巴细胞和中性粒细胞浸润、纤维增生等改变，3周后管腔纤维增生、管腔狭窄、气道壁和管腔内肉芽组织增生。异位气管移植操作简单，受体动物死亡率较肺移植及原位气管移植下降，然而，移植气管通常为较大气道，而BO多发生于终末细支气管，且移植气管无通气换气功能，气道不能完成清除功能，不符合人体气管的生理需求。Dutly等[14]提出了一种新型的动物模型，其中供体气管被植入到受体动物的肺实质中，尽管该方法比植入皮下更具技术挑战性，但其具有几个重要优点，其中一些优点是合适的局部环境，同时也为局部免疫抑制治疗提供了可能性。

良好的动物模型对于进一步剖析和揭示BO的发病机制是必不可少的，虽然已经开发了许多动物模型来研究BO，但到目前为止，这些模型都无真正模仿人类的情况[15]，且传统的移植模型需要的技术条件高，操作费时费力，术中和术后动物的死亡率高，发生BO病理改变周期较长，故近年来研究者更倾向于建立非移植的BO动物模型。

2 非移植模型

2.1 二乙酰2002年《新英格兰杂志》报道一家微波爆米花生产厂工作过的人有严重的BO病例[16]，暴露与结局之间的关系表明，他们可能因吸入挥发性黄油味成分二乙酰而患有职业性BO，此后便有相关学者采用口咽吸入、气管插管吸入二乙酰等方法构建BO模型[17-19]。邓华蓉等[20]在比较两种不同建造模型时发现，无论哪种给药方式，7 d后实验动物出现气道高反应，肺泡灌洗液中中性粒细胞浸润，肺组织病理切片显示气道上皮损伤脱落、气道管腔闭塞、支气管周围和血管周围大量炎症细胞浸润，上皮下大量胶原物质沉积，出现类纤维化等改变，但经口咽吸入组死亡率相对较高，且同时存在肠道上皮损伤，气管插管法给予二乙酰成功率更高。丁二酮造模相比较于移植模型，其能明显缩短BO病变出现的时间，缩短造模时间和成本，且病理表现典型，肺功能与临床BO结果相似，是BO模型的一种简单、快捷、稳定的方法。

2.2 硝酸早在1977年，Kleinerman等[21]发现吸入二氧化氮(NO2)会导致肺部损伤，一次暴露于高浓度的NO25～6 h会产生强烈的细胞增殖，终末呼吸细支气管区域和肺泡出现类似于BO的组织病变。Kubota等[22]利用二氧化氮诱发大鼠模型，发现实验大鼠在体积分数为0.004%的NO2暴露9个月后，支气管上皮细胞显示出典型的增生，18个月时病变进一步发展，Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖和间质组织水肿扩展明显，并在27个月时发生纤维化。为了缩短病理改变时间，Costa等[23]用硝酸(nitric acid，NA)进行诱导，在大鼠气管内滴入5 g·L-1NA，实验大鼠表现出十分明显的呼吸费力，活动量明显减少，稍加活动后呼吸困难更明显，随后出现食欲不振，虚弱无力，体质量进行性下降，毛发粗糙、无光泽等全身症状。研究者在第2、7、14和30天发现了组织学损伤，滴入NA的动物出现了一系列细支气管病变，包括巨噬细胞聚集、坏死性细支气管炎，支气管狭窄及管腔肉芽增生等。该模型与BO的组织学变化呈现相似性，可适用于该领域的进一步开发和治疗实验研究。

2.3 氯气氯是一种广泛使用的有毒化合物，吸入氯会损伤气道上皮细胞，导致肺部异常。氯暴露导致纤毛细胞从气管上皮脱落，在残留区域，上皮细胞修复效率低下，导致气道纤维化[24]。O’Koren等[25]描述了一种氯诱导的BO模型，在这种模型中，小鼠在暴露于氯气的情况下，10 d内出现气管和大气道闭塞性病变。其中，暴露后第2天炎症细胞浸润，第5天成纤维细胞浸润、胶原蛋白沉积，9～12 d出现致死性气道阻塞。但是由于上呼吸道内氯的吸收将改变对其对下呼吸道的毒性[26]，因此，暴露于低浓度的氯首先会对大气道造成损伤，而肺泡损害则需要暴露于高浓度的气体，而这样的暴露必定会造成同时的广泛气道损害。

2.4 硫芥第一次世界大战和伊朗-伊拉克战争中暴露于硫芥子气的受害者，以及遭受职业或偶然暴露的受害者，在暴露后的早期阶段就出现了呼吸系统症状，后期则出现明显的肺纤维化、闭塞性细支气管炎或肺癌等严重的慢性肺疾病[27]。基于硫芥子气对气道的损伤，Malaviya等[28]开发了一种硫芥子气毒性的大鼠模型，吸入硫芥子气蒸气在暴露后3 d，观察到近端细支气管上皮细胞水肿和炎症，以及在肺泡区炎症细胞的蛋白质渗出液，28 d出现更强烈的反应，包括上皮坏死和细支气管远端增生、肺泡壁增厚、空泡巨噬细胞增大和间质纤维化。虽然氯气吸入剂硫芥吸入构建的动物模型可以模拟人类吸入损伤性BO，但有毒气体吸入操作过程对研究者也存在暴露风险。

2.5 罂粟碱1995年8月，中国台湾爆发了一种与未煮熟野菜守宫木的食用有关的闭塞性细支气管炎[29]。这种植物的罂粟碱含量很高，随即Lai等[30]试图通过对大鼠喂食不同剂量的罂粟碱4周证实其对气道的损伤作用，但遗憾的是，实验中并未得出闭塞性细支气管炎结局，实验大鼠支气管周和血管周外膜的炎症变化正常或仅有很小的变化。Svetlecic等[31]改变了给药方式，利用微型渗透泵通过气管内泵入罂粟碱创建大鼠模型，第7天时便观察到支气管周围炎症、支气管黏膜损伤以及支气管周围胶原蛋白的增加，在28 d后出现了更广泛的损害，在肺匀浆中观察到T细胞生长因子-β和内皮型一氧化氮合酶显著升高。该模型可模拟药物诱发BO进而探索发病机制和诊疗策略。

3 感染模型

BO儿童中最常见的发病因素是感染，尤其以3岁前严重的病毒感染密切相关，30%～60%的感染后闭塞性细支气管炎(post-infectious bronchiolitis obliterans PIBO)为腺病毒所致[32]，因此，构建腺病毒诱导的PIBO实验模型，能够较好地反映病毒感染所致PIBO形成的病理生理过程。Castleman等[33]对比格犬进行实验性接种2型犬腺病毒，并在接种后1～26 d通过病毒学、组织学、免疫过氧化物酶和超微结构进行研究。接种后15、26 d观察到结缔组织细支气管的部分或完全狭窄。接种后26 d，病毒感染狗的右中叶平均终末细支气管横截面积减少了50%，实验性腺病毒感染在狗中会引起BO，该实验模型对于研究早期生命中腺病毒引起的肺损伤可能是有用的。但该模型尚未在啮齿类动物中得到验证，大型动物的饲养与操作，增加实验成本，故可复制性较差。

4 总结

动物模型是实验研究的基础，虽然近年来随着学术界对本病不断重视，围绕BO病因及发病机制而建立的动物模型不断增多，但目前国内对BO详细的动物模型研究尚未成熟。在造模方式上，移植手术法更符合BO发生的机制，但对操作者技术要求较高，且移植后实验动物死亡率较高。既往对于BO的动物模型，曾选用狗、家兔、仓鼠、大鼠、小鼠等。其中，大型动物的优势在于易于对其实施较为复杂的手术操作过程，但难于饲养，且不易获得研究所需的目的抗体。小鼠作为与人类具有高度同源性的哺乳类动物，是生命科学研究领域应用最为广泛的实验动物。在以小鼠为对象的非移植模型中，气管给药更加符合误吸、误食等BO发病过程，但操作难度较大；雾化更符合人体感染的天然途径，且操作简单，故其可作为感染后BO和某些挥发性物质吸入导致的BO的模型制备方式。对于研究者说，最重要的问题不是证明哪种模型是最好的，而是哪种是最合适的模型来检验研究者的科学假设。因此，充分发掘利用动物模型，并不断完善构建BO模型，对疾病的发病机制及治疗方法探索都具有重要意义。