巨噬细胞在器官移植免疫排斥反应中的研究进展

罗登科 综述 王毅，2 审校

1.海南医学院第二附属医院器官移植科，海南 海口 570100；2.海南医学院移植医学研究所，海南 海口 570100

器官移植是目前临床治疗终末期疾病最佳策略之一，是改善器官功能衰竭患者生存质量的希望。随着移植外科技术的成熟和免疫抑制新药的研发，受者术后短期发生移植排斥反应的比例逐渐下降，但长期存活率仍然较低。在移植术后第10年，只有约50%的死亡供体捐献器官和70%的活体供体捐献器官保持相对稳定的功能[1]。显然，移植排斥反应是一个极其需要解决的临床问题，目前所有免疫抑制方案仍然不能完全避免排斥反应发生。

当移植受者的免疫系统将供者的器官组织识别为“异己”时，会攻击移植物产生排斥反应。获得性免疫细胞起主导作用，T淋巴细胞则是其中之一。因此，抑制T淋巴细胞活性成为了抗排斥反应相关研究的着手点。钙调神经磷酸酶抑制剂使T淋巴细胞介导的排斥反应发生率明显下降。但一些移植受者在接受抗T淋巴细胞治疗后并没有形成免疫耐受，仍然会出现严重的排斥反应[2]。因此，T淋巴细胞可能不是唯一引起移植物排斥反应的细胞群。移植免疫排斥反应是固有免疫和适应性免疫系统之间相互作用的结果，固有免疫细胞通过抗原提呈或分泌细胞因子激活T淋巴细胞启动排斥反应。反之，活化T淋巴细胞会招募大量的固有免疫细胞，包括树突状细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等，这些细胞进入移植物后表达相关受体参与排斥反应。有研究发现，移植术后早期巨噬细胞明显增加，占浸润白细胞总数的50%[3]。移植物中的巨噬细胞主要为移植物内原有的巨噬细胞和血液中单核细胞迁移分化形成的巨噬细胞。巨噬细胞在免疫系统中发挥双重作用，既可以作为炎症效应细胞促进免疫反应的发生，又可作为免疫调节细胞抑制免疫应答。因此，巨噬细胞在器官移植排斥反应的作用不容忽视。现主要总结巨噬细胞分型、抗移植排斥反应作用、免疫耐受以及靶向抑制巨噬细胞等方面的研究进展。

1 巨噬细胞的极化表型与功能

巨噬细胞在微环境中受到某些诱导因素作用后产生特定细胞表型和功能的过程称为巨噬细胞极化。巨噬细胞有高度可塑性，在识别局部微环境改变后会发生表型的转换，以保持局部微环境稳态[4]。巨噬细胞传统上被分为两型：经典活化巨噬细胞(M1 型巨噬细胞)和选择性活化巨噬细胞(M2 型巨噬细胞) 。近年来，调节性巨噬细胞(regulatorymacrophages，Mregs)被证实是一类不同于M1和M2型巨噬细胞的亚型。M1型巨噬细胞可由γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等诱导产生，脂多糖/Toll 样受体4 信号通路是促进巨噬细胞极化为M1 型的重要通路[5]。M1型巨噬细胞具有促炎作用，释放炎症相关细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 等，抑制巨噬细胞M1 极化会缓解炎症反应[6]；产生活性氧物质激活多种促炎途径，如TAK1、MAPK、NLRP3和NF-κB，引起糖尿病状态下的血管内皮细胞损伤，有助于糖尿病微血管并发症的发生[7]；通过分泌外泌体放大辅助性T 细胞反应，加强固有免疫和适应性免疫间的相互作用[8]。此外，M1型巨噬细胞增强抗肿瘤免疫力，抑制肿瘤生长和转移，是一种新的肿瘤免疫治疗方法[9]。M2型巨噬细胞可由白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白细胞介素13(interleukin-13，IL-13)等诱导产生。M2 型巨噬细胞又可分为四个亚群：M2a 型巨噬细胞、M2b 型巨噬细胞、M2c 型巨噬细胞、M2d 型巨噬细胞[10]。其中M2b 型巨噬细胞在炎症性疾病中发挥重要作用，特别是在自身免疫性疾病中。研究表明，M2b 型巨噬细胞在系统性红斑狼疮的发病中起着直接作用[11]。M2 型巨噬细胞分泌IL-10 等抗炎细胞因子减轻炎症反应[12]；参与组织损伤后的修复与再生，有研究发现药物性肝损伤患者肝脏的再生与修复与M2型巨噬细胞数量增加有关[13]；M2型巨噬细胞可促进非小细胞肺癌转移[14]；具有调节细胞免疫作用，通过上调程序性死亡配体1 的表达，抑制小鼠外周血中CD4+/CD8+T 细胞，并增加骨髓中CD4+CD25+调节性T细胞数量[15]。调节性巨噬细胞(regulatory macrophages，Mregs)是一类相对独特的巨噬细胞亚型，主要由单核细胞在刺激下诱导分化而来，具有负向免疫调节功能。Mregs 主要由巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)、LPS 和IFN-γ诱导生成，能够分泌IL-10、转化生长因子β (transforming growth factor β，TGF-β)等抗炎细胞因子调节免疫反应活性。目前Mregs 的特异性标志物尚不清楚，有人认为树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3 结合非整合素因子可作为小鼠Mregs 的特异性标志物之一[16]。Mregs 对固有免疫和获得性免疫均有抑制作用。Mregs可直接抑制T淋巴细胞增殖，也可通过分泌IL-10或诱导调节性T淋巴细胞生成等间接抑制机体免疫反应。研究发现经抗体介导吞噬作用的调节性巨噬细胞通过上调程序性死亡配体1 的表达发挥抑制NK 细胞和T 细胞介导的细胞毒性达到抗肿瘤免疫效应[17]。

2 巨噬细胞在同种异体移植排斥反应中的作用

2.1 巨噬细胞在急性排斥反应中的作用 随着免疫抑制剂的广泛应用，急性排斥反应发生率明显下降，但仍然是移植后常见并发症，而且急性排斥反应的发生机制仍不完全清楚。急性排斥反应多发生于器官移植术后数小时至一个月内，可分为抗体介导的急性排斥反应(antibody mediated rejection，AMR)和T淋巴细胞介导的急性排斥反应(T cell mediated rejection，TCMR)。巨噬细胞浸润是同种异体移植急性排斥反应的一个特征。BERGLER 等[18]研究了103 例肾移植受者在AMR和TCMR期间巨噬细胞在移植肾中的浸润程度，发现移植肾中巨噬细胞的数量显著增加，而且与移植肾的功能稳定和存活时间有关。因此，巨噬细胞可能是监测排斥反应、移植物功能和预后的潜在标志物。有趣的是，研究发现供体来源的巨噬细胞在心脏移植急性排斥反应中起关键作用[19]。当发生急性排斥反应时，移植物中的巨噬细胞多表现为M1 表型，分泌大量的促炎细胞因子破坏血管内皮完整性和诱导细胞毒性T 细胞生成增强适应性免疫应答，造成移植物组织间接损伤[20]。巨噬细胞产生活性氧等氧化物导致同种异体移植组织损伤，从而促进急性排斥反应[21]。在急性排斥反应的移植受者中，移植前M2 型巨噬细胞表面标志物CD163 呈较高表达水平，移植后1 周仍有表达，提示M2 型巨噬细胞可能在肾移植术后早期排斥中发挥作用[22]。然而，KO等[23]观察小鼠角膜移植物的病理切片发现无急性排斥反应的角膜中存在大量M2型巨噬细胞，提示M2型巨噬细胞对角膜移植物起保护作用。巨噬细胞通过激活适应性免疫触发移植排斥反应。具有抗原呈递作用的巨噬细胞通过MHC-抗原肽复合物激活T 淋巴细胞，同时提供共刺激信号以激活T淋巴细胞。此外，巨噬细胞能够诱导Th17 细胞的分化调节排斥反应。浆细胞识别巨噬细胞递呈的抗原后分泌特异性抗体导致抗体介导的急性排斥反应的发生。巨噬细胞介导急性排斥反应致使移植物丢失的机制还不完全清楚。有研究团队在裸鼠皮肤移植AMR模型中发现三磷酸核苷双磷酸水解酶1可以水解巨噬细胞外二磷酸腺苷为单磷酸腺苷，引起巨噬细胞外二磷酸腺苷减少，抑制其静息状态，并促进巨噬细胞活化，从而导致移植物损伤[24]。

2.2 巨噬细胞在慢性排斥反应中的作用 移植后免疫抑制剂的使用降低了急性排斥反应的发生率，然而提高移植物的长期存活率仍然是一个挑战。急性与慢性排斥反应对于移植物的影响有差别。急性排斥反应主要影响移植物功能的发挥，而慢性排斥反应则是影响移植物的长期存活。慢性排斥反应主要表现为组织纤维化和移植物血管性疾病。组织纤维化是慢性排斥反应导致移植物丢失的重要原因，而促炎型巨噬细胞与移植物组织纤维化有关，但巨噬细胞如何促成纤维化尚不清楚。纤维化引起的慢性移植物损伤是移植术后常见的远期并发症,表现为移植物功能进行性减退。研究发现M2型巨噬细胞促使移植肾上皮组织向间质转化，导致移植肾间质纤维化[25]。移植肾间质纤维化依靠肌成纤维细胞的增殖，巨噬细胞向肌成纤维细胞的转化过程可能通过Smad3 机制进行调节[26]。移植物血管性疾病是慢性排斥反应的另一种表现，表现为新血管内膜形成和进行性血管狭窄，最终导致移植物缺血坏死[27]。在发生慢性排斥反应的同种异体移植物中，巨噬细胞和CD4+T 细胞在移植物血管周围聚集。巨噬细胞通过旁分泌信号，激活成纤维细胞和血管平滑肌细胞，这两者有助于血管纤维内膜增厚。巨噬细胞还参与形成新生淋巴管。SATO 等[28]发现移植肺的慢性呼吸功能损伤与新生淋巴管有关，后者可以促进慢性炎症反应，加重排斥反应，其原因可能是巨噬细胞分泌的血管内皮生长因子、TNF-α促进淋巴管再生。因此，可以通过调节巨噬细胞功能减少移植物淋巴管再生，从而改善移植物的预后。在发生慢性排斥反应的移植物中，巨噬细胞以M2亚群浸润为主。有研究表明，术后1年移植物中约92%的巨噬细胞表现为M2 表型，且巨噬细胞总数与纤维化程度呈正相关[29]。虽然慢性排斥反应以M2 型巨噬细胞为主，但活性氧和INF-γ的产生往往提示M1型巨噬细胞的存在。由于巨噬细胞的可塑性，很难分辨出移植物中确切的巨噬细胞表型，可能一部分巨噬细胞正在进行表型的极化，或者在慢性排斥反应的某个时间点，巨噬细胞表现出双重特征[30]。

3 巨噬细胞在异种移植排斥反应中的作用

异种移植有希望解决移植器官数量短缺问题，而异种免疫排斥反应是需要解决的首要问题。敲除猪体内主要的异种抗原基因可明显减少猪到灵长类动物异种移植超急性排斥反应的发生，如α-1,3-半乳糖基转移酶(GalT)、N-羟基神经氨酸(Neu5Gc)、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺转移酶(β4GalNT2)[31]。巨噬细胞主要参与异种移植急性排斥过程，其激活可能受以下机制影响：(1)抗排斥反应信号通路蛋白跨物种不相容性，如CD47 和CD47信号调节蛋白α；(2)抗原抗体免疫复合物；(3)T 细胞与NK 细胞相互作用；(4)识别危险相关分子模式[32]。

巨噬细胞激活中性粒细胞加剧异种移植物炎症反应，也可通过吞噬中性粒细胞减轻炎症。移植物局部的固有免疫反应刺激T 淋巴细胞活化与增殖，后者反过来激活巨噬细胞，从而使巨噬细胞在异种移植免疫排斥反应中发挥直接效应细胞的作用。持续激活的巨噬细胞产生TNF-α、活性氧以及补体破坏异种移植物，但巨噬细胞能够表达抑制性受体调节免疫排斥反应。

4 巨噬细胞在移植免疫耐受中的作用

近年来，调节性巨噬细胞成为移植免疫耐受的热点。Mregs 是一类功能上与M1、M2 型巨噬细胞不同且相对独立的亚群，具有调节免疫应答作用[33]。调节性巨噬细胞是一种免疫抑制细胞，能够抑制过度的移植免疫反应，从而使宿主对移植物产生免疫耐受。Mregs 可以延长未使用免疫抑制方案的同种异体小鼠心脏移植存活时间，其与Mregs 通过一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)途径和分泌抗炎因子抑制T淋巴细胞增殖有关[34]。在使用CD40/CD40L阻断剂的移植免疫耐受研究中发现，C5a补体受体C5aR1促进血液循环中的单核细胞向移植物迁移并向Mregs 分化，成功诱导小鼠心脏移植免疫耐受[35]。CD40L 单克隆抗体可促进Mregs 浸润移植物，促进调节性T 淋巴细胞的增殖，同时减少CD8+T淋巴细胞的聚集[16]。

M2 型巨噬细胞发挥抗炎作用的同时诱导免疫耐受。在小鼠同种异体胰岛移植免疫耐受模型中，经粒细胞集落刺激因子处理后明显增加了M2型巨噬细胞在移植物中的浸润程度，后者增强了调节性T细胞免疫耐受的诱导作用[36]。有研究将体外诱导的M2 型巨噬细胞回输到胰岛移植小鼠体内，结果表明M2 型巨噬细胞表现出稳定的抗炎作用和免疫抑制能力，提示体外诱导M2型巨噬细胞可作为诱导移植免疫耐受的一种有效方法[37]。关于M2 型巨噬细胞形成免疫耐受的调控机制尚不明确，需进一步阐明其作用机制。

使用纳米颗粒将免疫调节药物运输到巨噬细胞中，可诱导巨噬细胞形成免疫耐受。在小鼠皮肤移植模型中，通过纳米颗粒输送霉酚酸类药物(MPA)，比传统的MPA疗法显著延长了移植物存活时间，其机制可能是巨噬细胞摄取纳米颗粒后会导致程序性死亡配体-1表达上调，降低了巨噬细胞激活T淋巴细胞的能力[38]。

5 调节巨噬细胞抗排斥功能

针对性巨噬细胞治疗能减轻巨噬细胞引起的排斥反应，包括减少巨噬细胞浸润、调节巨噬细胞亚群、抑制巨噬细胞炎症作用、诱导调节性巨噬细胞生成等。Ras同源基因家族成员A(RhoA)通过调控趋化因子1 表达抑制巨噬细胞向血管内皮迁移，当巨噬细胞缺失RhoA基因后，抑制了巨噬细胞的浸润，减少移植血管病变和间质纤维化[39]。在一项研究中，间充质干细胞转染表达的可溶性纤连蛋白样蛋白2 通过诱导M2 巨噬细胞极化调节免疫耐受，从而抑制小鼠心脏移植急性排斥反应[40]。M2c 型巨噬细胞是以分泌IL-10和TGF-β1为特征的巨噬细胞亚群。将大鼠骨髓来源的M2c型巨噬细胞注入肝移植大鼠体内，观察到移植物中CD8+T 淋巴细胞明显减少，肝功能得以改善，表明巨噬细胞向M2c 表型的极化改善了大鼠肝移植模型的急性排斥反应，并可能为急性排斥反应提供一种有效的治疗方法[41]。

促炎型巨噬细胞分泌促炎因子加重移植物的排斥反应。载有雷帕霉素(mTORi)的高密度脂蛋白(HDL)纳米颗粒可抑制巨噬细胞的促炎活性，在心脏移植模型中，mTORi-HDL 减少浸润移植物的炎性巨噬细胞数量和增加抗炎型巨噬细胞的数量，显著延长移植物存活时间[42]。纳米颗粒技术可能成为器官移植术后靶向巨噬细胞的治疗方法。IL-10具有抗炎和免疫调节作用，已被证明通过抑制巨噬细胞来限制炎症反应。有研究利用猪肾小管上皮细胞转染人IL-10的基因，发现促炎细胞因子明显减少，降低人巨噬细胞对猪肾小管上皮细胞的细胞毒作用，缓解了异种移植急性免疫排斥反应，这与IL-10诱导M2型巨噬细胞生成有关[43]。IL-33在移植后早期限制移植物中炎性巨噬细胞，减轻慢性排斥反应。缺少表达IL-33的心脏移植会发生慢性排斥反应，从而加速移植物的丢失[44]。

由于调节性巨噬细胞能够诱导移植免疫耐受，其在器官移植中显示出巨大的治疗潜力。调节性巨噬细胞可直接抑制T 淋巴细胞的增殖，还可诱导调节性T 细胞分泌IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子，间接抑制机体的免疫反应。有研究表明体外产生的人调节性巨噬细胞可作为异种细胞间免疫反应的强效抑制剂，明显抑制了异种混合淋巴细胞反应中的CD4+和CD8+T 淋巴细胞，而且IFN-γ能增强其抑制能力[45]。通过M-CSF途径在体内促进Mregs极化也为器官移植受者提供了一种新的治疗方法。中性粒细胞分泌的集落刺激因子1 促进Mregs生成和增强移植物中巨噬细胞的免疫抑制功能[46]。调节性巨噬细胞抑制活化T淋巴细胞，并诱导调节性T淋巴细胞的分化，有利于重建移植受者免疫耐受状态。然而，在调节性巨噬细胞应用到临床之前，还需要进一步的研究，必须解决调节性巨噬细胞的许多问题，包括Mregs的诱导分化效率、功能稳定性和体内的可塑性等等。

6 小结

器官移植是挽救终末期器官功能衰竭患者生命的可靠手段。虽然实体器官移植在移植物短期存活率方面取得了较好的效果，但长期预后并没有令人满意的实质性改变。目前免疫抑制方案主要针对的是适应性免疫系统，而不是固有免疫系统，同时针对适应性免疫和固有免疫系统的治疗可能改善移植物长期存活。发生移植免疫排斥反应的机制是多种因素造成的，越来越多的证据表明巨噬细胞是移植物发生急性、慢性排斥反应的关键细胞，其通过分泌炎症介质激活适应性免疫反应，造成移植物功能减退。然而，并不是所有的巨噬细胞都能促进移植排斥反应。不同的巨噬细胞亚群的功能不完全相同，某些巨噬细胞亚群可启动保护机制调节移植免疫反应。因此，调控巨噬细胞向具有免疫调节功能的表型极化可能为提高移植物长期存活率提供新的治疗思路，基于巨噬细胞的靶向治疗也许是一种改善移植物预后的方法。