免疫细胞耗竭对带瘤生存的影响及中医扶正法干预治疗研究进展※

刘凯乐 邓海滨

(上海中医药大学附属龙华医院肿瘤二科，上海 200032)

免疫系统具有识别和排除抗原性异物，维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。免疫细胞耗竭是指在慢性感染和肿瘤状态下，因为抗原或炎症状态的持续存在，CD8+T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞逐渐失去效应能力的现象，其主要特征是抑制性受体高表达[1]。除此之外，CD4+T淋巴细胞[2]、B淋巴细胞[3]等也会发生耗竭。恶性肿瘤在目前医疗技术条件下是一种无法被治愈的疾病，因此长期带瘤生存成为临床治疗的努力方向。研究表明，CD8+T淋巴细胞耗竭和NK细胞耗竭与恶性肿瘤的侵袭、转移及患者预后生存情况密切相关。现就有关免疫细胞耗竭对带瘤生存的影响及中医扶正干预治疗的研究进展进行综述，为中医干预治疗恶性肿瘤、逆转免疫细胞耗竭、延长患者带瘤生存时间提供参考。

1 免疫细胞耗竭

1.1 T淋巴细胞

1.1.1 T淋巴细胞耗竭特点 T淋巴细胞耗竭是指功能障碍的CD8+T淋巴细胞在细胞因子的释放和免疫应答方面受到限制，导致肿瘤细胞免疫逃逸，降低肿瘤免疫治疗的效果[4]。在肿瘤微环境中，CD8+T淋巴细胞功能紊乱，如耗竭、衰老，限制了有效抗肿瘤免疫治疗的发展[5]。CD8+T淋巴细胞耗竭通常是在慢性感染或肿瘤情况下发生，这是CD8+T淋巴细胞的一种功能缺陷状态，一个重要特征是多种共抑制受体如程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT)、CD39、B/T淋巴细胞弱化因子(BTLA)等的共同表达，同时功能耗竭的CD8+T淋巴细胞还可分泌大量的外泌体，被正常的CD8+T淋巴细胞摄取，并损害其增殖、细胞活性，导致白细胞介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、颗粒酶B(GZMB)等细胞因子产生减少[6]。微阵列检测发现257个候选长链非编码RNA(LncRNA)在耗竭和未耗竭的CD8+T淋巴细胞外体中有不同的表达，这些LncRNA积极参与了CD8+T淋巴细胞代谢、基因表达、生物合成等多种过程的调控[7]。CD8+T淋巴细胞的功能丧失是递进性发生的，在肿瘤早期是IL-2产生和细胞因子多功能性减退，细胞高增殖能力丧失，随后是TNF-α、IFN-γ及趋化因子、脱颗粒能力的缺陷[8]。与终末期耗竭的CD8+T淋巴细胞不同，CD4+T淋巴细胞的终末耗竭表现为CD39的表达，而不是TIM-3的表达，肿瘤浸润的CD4+T淋巴细胞上T细胞因子1(TCF-1)和细胞信号转导淋巴细胞激活分子家族6(SLAMF6)的表达下调，这表明肿瘤内更多的CD4+T淋巴细胞进入终末衰竭状态，CD4+T淋巴细胞上TIGIT的表达也与终末期的疾病有关[9]。

1.1.2 T淋巴细胞发生耗竭的机制 T淋巴细胞发生耗竭是通过不同的机制抑制T淋巴细胞的活化及增殖，包括通过受体竞争限制共刺激，通过限制信号分子的磷酸化直接抑制T淋巴细胞受体(TCR)下游的信号转导，抑制代谢变化、转录水平变化、干扰增殖或抑制炎症信号等[10]。肿瘤微环境中的缺氧条件被认为是促进肿瘤进展的效应方式。具体地说，缺氧以缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)依赖的方式触发肿瘤细胞中程序性死亡配体-1(PD-L1)的上调，缺氧降低了线粒体的代谢和功能，这与在肿瘤微环境中含有功能障碍的T淋巴细胞或耗竭的T淋巴细胞所观察到的线粒体代谢状态是一致的。MicroRNA-24诱导的原癌基因MYC下调，在肿瘤微环境中对T淋巴细胞耗竭的发展起着重要的作用[11]。Sprouty蛋白1(SPRY1)在耗竭的T淋巴细胞中表达上调，以及SPRY1对TCR信号强度的抑制作用，可能是肿瘤中新的T淋巴细胞耗竭机制，SPRY1通过碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)诱导在T淋巴细胞耗竭中起重要作用[12]。肿瘤细胞可产生高乳酸，使肿瘤微环境的酸性增加，导致CD8+T淋巴细胞激活后增殖和产生效应细胞因子等关键反应受到抑制[13]。CD4+T淋巴细胞的耗竭会增加肿瘤微环境中终末耗竭CD8+T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞17(Tc17)的频率，产生的IL-17会促进CD8+T淋巴细胞的最终耗竭[14]。晚期CD8+效应T淋巴细胞中神经纤维蛋白1(NRP-1)的丢失，通过降低细胞周转率和干细胞样的自我更新表型来限制终末的耗竭，这可能会促进向功能性长寿记忆细胞的分化[15]。最近的一项研究表明，在T淋巴细胞耗竭过程中，DNA甲基化是建立表观遗传程序所必需的，并限制了PD-1靶向治疗后T淋巴细胞耗竭的恢复[16]。

1.2 NK细胞

1.2.1 NK细胞耗竭特点 大多数外周NK细胞是CD56dimCD16+，具有快速介导细胞毒作用的特点，CD56brightCD16-NK细胞群约占外周NK细胞的10%，其特征是穿孔素产量低，但IFN-γ和TNF-α的产生正常[17]。大量文献研究表明，NK细胞是通过细胞表面受体识别肿瘤细胞，活化性受体与抑制性受体之间保持着动态平衡，通过触发自身活性而达到杀伤靶细胞的目的[18]。NK细胞是否会杀死目标取决于NK细胞表面活化和抑制受体传递信号的平衡，活化性受体包括NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、CD244、DNAX辅助分子-1(DNAM-1)，抑制性受体包括杀伤免疫球蛋白样受体(KIRS)、CD94/NKG2A，NK细胞一旦做出了杀伤靶细胞的决定，就会释放含有细胞溶解酶穿孔素和颗粒酶的细胞毒颗粒，从而导致靶细胞的溶解[19-20]。NK细胞不需要通过预先致敏产生影响获得性免疫细胞的炎症细胞因子如IFN-γ等杀死肿瘤细胞[21]，而可以直接杀伤从血液和实体肿瘤中分离出来的肿瘤细胞，效率非常高[22-23]。研究表明，由肿瘤微环境免疫抑制介质诱导的慢性炎症可通过耗尽免疫细胞，如NK细胞来促进肿瘤的进展[24]。抑制性受体提供的负反馈是NK细胞免疫调节的关键，肿瘤细胞可以利用这种负反馈系统与抑制性受体相结合，引起NK细胞免疫检查点分子的过度表达，导致这些细胞的激活减少和功能衰竭，其表型特征就是NK细胞凝集素样受体G亚族成员1(KLRG1)上调和激活受体NKG2D下调[25-26]。

1.2.2 NK细胞耗竭机制 肿瘤微环境可对NK细胞进行重新编程，使其处于耗竭状态，PD-1表达增加，转录因子[如T细胞特异性转录因子(T-bet)、脱中胚蛋白(Eomes)]表达降低[27]。肿瘤微环境中转化生长因子-β(TGF-β)的过表达是肿瘤抑制NK细胞的重要因素，TGF-β由肿瘤细胞、调节性T淋巴细胞和骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)分泌，TGF-β可下调NK细胞表面活化受体NKP30和NKG2D[28]。细胞因子在NK细胞存活和维持中的重要作用已经得到了充分证实，如IL-15缺失已被证明会导致NK细胞在24 h内迅速凋亡，同时细胞因子剥夺被认为是效应性T淋巴细胞扩增后导致其活性受到抑制的关键机制[29]。有文献研究表明，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)能够直接改变NK细胞的细胞毒性和表型，是通过接触依赖的机制来抑制NK细胞对靶细胞的杀伤作用[30]。有研究指出，肿瘤微环境可通过针对T淋巴细胞和NK细胞共受体TIGIT使NK细胞进入免疫耗竭，而TIGIT单抗可以提高T淋巴细胞和NK细胞的抗肿瘤能力[31]，与疾病中自愈小鼠相比较，持续慢性感染小鼠的NK细胞表达TIGIT水平更高[32]。在CD155过表达的肝癌研究中显示，CD96+NK细胞与CD155+肿瘤细胞之间的相互作用增加，可绕过CD226的激活信号，导致NK细胞表型耗竭、功能受损，阻断CD96和CD155相互作用可以有效地逆转CD96诱导的细胞衰竭，恢复NK细胞的正常免疫应答[33]。有研究还显示，CD226表达下调和NKG2A表达上调可作为肺癌NK细胞耗竭的潜在标志物，并可作为未来改善NK细胞抗肿瘤免疫监测策略的靶点[34]。

2 带瘤生存

带瘤生存是目前恶性肿瘤的治疗方向之一，且逐渐被大众所接受，其是从关注瘤体的缩小转变到注重患者生活质量提高，适应情况主要有以下3种：①肿瘤扩散且不能完全切除者；②重要脏器部位的肿瘤无法被切除者，例如胸、腹主动脉等；③对放疗、化疗及其他辅助治疗不敏感或无法耐受手术治疗者[35-36]。提高机体免疫力，稳定肿瘤病灶，使肿瘤患者达到无进展生存，使人体与肿瘤和谐共存，这就是带瘤生存的主要目标[37]。

2.1 免疫耗竭中抑制性受体表达对带瘤生存的影响 在肿瘤微环境中，PD-1/PD-L1结合对T淋巴细胞的活化起负向调节作用，可产生IL-10等免疫抑制性因子，诱导初始CD4+T淋巴细胞向Foxp3+调节性T细胞方向分化，从而使得肿瘤细胞逃避免疫监视[38-39]。在临床决策中，PD-L1蛋白表达检测是免疫检查点抑制剂(ICI)使用的生物标志物[40]。在肾细胞癌研究中表明，PD-L1的情况表达可对患者的生存提供很好的预后评估价值[41-42]。PD-1在乳腺癌肿瘤浸润淋巴细胞中的表达强度也与肿瘤的大小、分期及预后相关，在luminal B型 HER2-、luminal B型HER2+、HER2过表达型和基底细胞型等各型乳腺癌中PD-1L的表达也与预后呈负相关[43-44]。有关非小细胞肺癌(NSCLC)的研究显示，NSCLC患者淋巴细胞表面CTLA-4、PD-1、TIM-3阳性表达率与患者的TNM分期或淋巴结转移状态具有一定联系，其免疫抑制因素可能促进肿瘤转移[45]。肝癌患者肿瘤组织的NK细胞中NKG2A的表达明显高于正常肝组织，NKG2A和NKG2A配体(HLA-E)的表达与肝癌患者生存期较短密切相关，提示患者瘤内组织中NK细胞耗竭[46]。有文献表明，T淋巴细胞耗竭与TIM-3及其他检查点受体的上调有关，与不良的临床结局相关，TIM-3的扩增表达与疾病进展和较短的生存期有关[47-48]。在人肝癌组织中有高比例的TIM-3表达，会支持肿瘤细胞的生长，而抗TIM-3抗体或TIM-3基因敲除小鼠则会抑制肿瘤生长，TIM-3受体实际上激活了肝细胞中核转录因子-κB(NF-κB)的磷酸化，最终触发IL-6的分泌和信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)的磷酸化，提示TIM-3介导的肿瘤微环境的免疫缺陷有可能成为肿瘤治疗的新靶点[49]。TIGIT是一种表达在活化的T淋巴细胞、NK细胞和调节性T淋巴细胞上的免疫检查点受体，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上TIGIT受体表达升高与TIL细胞因子产生减少和总体存活率差相关[50]。TIGIT的表达与大肠癌的预后也紧密联系，TIGIT表达可抑制T淋巴细胞分泌细胞因子，导致CD8+T淋巴细胞功能衰竭，与大肠癌患者的复发和生存有关[51]。肿瘤浸润性NK细胞的TIGIT表达与细胞功能衰竭和肿瘤进展有关，敲除TIGIT基因的NK细胞可显著抑制体内肿瘤的生长，阻断TIGIT可逆转NK细胞耗竭，增强NK细胞介导的抗肿瘤免疫[30]。综上所述，免疫细胞的抑制性受体表达可使肿瘤细胞进一步免疫逃逸，促进肿瘤的发展和转移的发生，导致患者的生存期缩短并伴随不良的预后，即不利于病灶的稳定和带瘤生存的实现。

2.2 ICI逆转免疫细胞耗竭对带瘤生存的影响 NK细胞衰竭通常由肿瘤进展和慢性感染引起，从而削弱NK细胞的抗肿瘤和抗感染能力，免疫检查点的阻断是逆转衰竭的重要环节[52]。在临床上，已经将免疫检查点，如PD-1/PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT等作为抗肿瘤和抗感染治疗的关键靶点，且在逆转CD8+T淋巴细胞耗竭中显现希望，预测评价抗PD-1治疗疗效的潜在指标是TIM-3在肿瘤细胞中的表达情况[53-54]。在一项有关晚期黑色素瘤患者NK细胞中TIM-3的表达和功能的研究中发现，这些受试者NK细胞TIM-3表达水平明显升高，细胞功能受损或衰竭，通过TIM-3阻断干预可逆转这种耗竭的表型，并且NK细胞中TIM-3的表达随着黑色素瘤分期的进展而增加，在预后因素较差的患者中表达更高[55]。有研究认为，胃癌细胞LAG-3和TIM-3抑制配体的表达可作为观测抗PD-1治疗疗效的潜在生物标志物，以PD-1、TIM-3、LAG-3为靶点的ICI联合免疫治疗对胃癌患者有治疗潜力[56]。通过阻断TIGIT能够逆转NK细胞耗竭，对肿瘤清除和小鼠的生存周期均有积极作用，并能抑制多种肿瘤的增长[57]。在缺乏获得性免疫的情况下，用单克隆抗体阻断脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的蛋白(PVRIG)可以起到治疗作用，可增强人NK细胞功能，并且可抑制NK细胞或外周血单个核细胞(PBMC)重组异种移植鼠的肿瘤生长[58]。B7-H7是免疫治疗的另一个靶点，B7-H7在耗竭的辅助性T淋巴细胞1(Th1)和细胞毒性T淋巴细胞1(Tc1)上优先表达，TNF-α和IFN-γ分泌受到影响，阻断B7-H7及CD28，可促进T淋巴细胞增殖和活化[59]。IL-10/Fc融合蛋白是一种安全和高效的代谢干预方法，通过促进T淋巴细胞的线粒体氧化磷酸化，诱导终末耗竭的T淋巴细胞恢复活力，增强其细胞毒功能，从而增强抗肿瘤免疫，达到癌症免疫治疗的目的，其治疗模式与ICB治疗模式不同，两者合用可起到相辅相成的作用[60]。综上所述，ICI已经成为了肿瘤免疫治疗的新靶点，以期逆转肿瘤免疫抑制状态，延长患者生存时间，提高生活质量，成为“带瘤生存”的助推剂，并能使部分患者免疫细胞耗竭得到逆转。

3 中医扶正法干预治疗

3.1 中医扶正法逆转免疫细胞耗竭对带瘤生存影响的理论依据 《素问·刺法论》有言：“正气存内，邪不可干。”中医学的正气就是指人体对疾病的防御、抵抗和再生的能力。《素问·六元正纪大论》言：“大积大聚，其可犯也，衰其大半而止，过者死。”也提出在大积、大聚等重大疾病的治疗过程中不可过度攻伐，要尚留正气，以此攻邪。因此，扶正抗癌是中医治疗肿瘤的重要法则之一，通过扶助机体正气，调节机体免疫功能，而达到治疗肿瘤的目的，在肿瘤患者免疫清除、免疫均衡、免疫逃逸的调节过程中发挥着重要作用[61-62]。国医大师刘嘉湘教授融汇中西医学治疗肿瘤的优势，系统提出了“扶正治癌”的观点，并经过不断研究完善，构建了“道、法、术、理”的“扶正治癌”学术思想体系，其中“道”就是以人为本，人瘤并重，以提高患者的生活质量、延长生存期为主要目标；“法”就是扶正治癌，辨证论治，扶正为主，佐以祛邪，促进恢复阴阳平衡；“术”就是形神并调，内外兼治，有机整合各种内外治法，重视心身调摄；“理”就是调控免疫，精准治癌，通过辨证达到精准治疗,以提高患者免疫功能而实现稳定病灶、延长带瘤生存期的目的[63-64]。徐振晔教授认为，肺癌是一种本虚标实、因虚致实的疾病，肿瘤局部的实证正是全身脏腑虚损的表现，推崇张景岳“阴精阳气同源相生”的治虚理论，采用益气养精扶正、抑癌解毒祛邪的方法治疗，同时注重患者内外环境的平衡，对本虚标实的肿瘤患者有既病防变的作用[65-66]。

3.2 中医扶正法逆转免疫细胞耗竭对带瘤生存影响的临床应用 范忠泽以刘嘉湘教授“扶正治癌”的学术思想为指导，提出“全身扶正，局部治癌”的观点，认为肺癌与肺、脾、肾三脏正气虚损关系密切，肺癌初期，邪毒不深，正气尚充，以补脾益气为法，常用四君子汤加减治疗；肺癌后期，邪毒伤正，正气不复，久病及肾，临证应兼顾先后天，常用六味地黄丸、左归丸、肾气丸等加减治疗，可显著延长患者的生存期[67]。项怡等[68]采用益气养精法(化疗期间予抗瘤增效方治疗，药物组成：七叶胆、女贞子、灵芝、苍术、黄连、生黄芪、黄精；化疗结束后予肺岩宁方治疗，药物组成：灵芝、黄精、淫羊藿、石见穿、女贞子、山茱萸、白术、山慈茹、七叶一枝花、蜂房、干蟾皮、黄芪)联合化疗治疗老年晚期NSCLC患者51例，并与单纯化疗治疗48例对照观察。结果：治疗组中位生存期(467±61.28)d，对照组中位生存期(389±29.69)d，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但治疗组稍高于对照组，且治疗组治疗后卡氏功能状态评分(KPS)、体质量、中医证候评分改善均优于对照组(P<0.05)。冯蓓等[69]采用扶正祛邪中药(药物组成：黄芪、党参、白花蛇舌草、薏苡仁、当归、茯苓、姜黄、大黄、女贞子、枸杞子、莪术、菟丝子、夏枯草、白术、川贝母、紫草、炙甘草)联合顺铂联合同步放疗治疗中晚期宫颈癌78例，并与单纯采用顺铂联合同步放疗治疗78例对照观察。结果：治疗组总有效率76.9%，对照组总有效率47.4%，治疗组疗效优于对照组(P<0.05)，且治疗组治疗后T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平改善均优于对照组(P<0.05)，KPS高于对照组(P<0.05)。张双科等[70]采用益气解毒中药(药物组成：人参、黄芪、茯苓、熟地黄、川芎、当归、浙贝母、香附、猫爪草、夏枯草、三棱、莪术、甘草)联合靶向药物治疗Her-2阳性晚期乳腺癌65例，并与单纯采用靶向药物治疗65例对照观察。结果：治疗组总有效率92.31%，对照组总有效率78.46%，治疗组疗效优于对照组(P<0.05)，且治疗组治疗后T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及免疫蛋白A(IgA)、IgG、IgM水平改善均优于对照组(P<0.05)。综上所述，中医扶正法治疗恶性肿瘤能提高免疫细胞活性，改善患者免疫功能，延长患者的带瘤生存期。

4 讨论与展望

在肿瘤微环境中，各种免疫细胞因抗原持续暴露等原因而产生细胞耗竭，从而不能发挥其正常的免疫功能清除抗原，造成肿瘤细胞的不断增殖和免疫逃逸等现象。在肿瘤局部，免疫细胞的抑制性受体高表达，可能伴随着患者的生存时间大大缩短，同时免疫细胞的耗竭也会导致肿瘤复发和转移，所以在一定程度上，免疫细胞耗竭决定了患者带瘤生存时间的长短。在疾病的发生与发展过程中，中医学非常重视正气与邪气的相互关系，即所谓“正气存内，邪不可干”，然而肿瘤患者往往为本虚标实之证，全身正气不足，局部邪气亢盛，即“邪之所凑，其气必虚”。中医学理论体系中的“正气”与现代医学中的“免疫能力”存在一定程度的吻合，“扶正法”治疗肿瘤的本质就是通过调节机体的免疫功能，“唤醒”发生耗竭的免疫细胞，逆转免疫细胞耗竭的现象，从而延长患者的带瘤生存时间。同时我们还应认识到，肿瘤作为一种重特大疾病，中医扶正法虽然在其治疗过程中取得了一定成果，但整体疗效的判定、具体的作用机制及有效成分的研究尚且不足，有待日后进一步加强，充分发掘中医治疗肿瘤的优势，提高患者的生活质量，延长患者的生存时间，把肿瘤变成一种慢性病，实现真正的“带瘤生存”。