甜樱桃“三早二选一促”高效育种方法

吴雅琴，程和禾，陈 龙，李玉生，高 倩，郭 勇，吴永杰，赵艳华

（河北省农林科学院昌黎果树研究所 河北 昌黎 066600）

甜樱桃具有结果早，见效快、绿色安全等优点，近年来发展势头迅猛，栽培面积达23.33 万hm2以上，单位面积产值远远高于其它树种，已成为新的经济增长点，也是农民增收的重要树种。但在甜樱桃产业快速发展的过程中，一些制约产业发展的瓶颈问题也暴露无遗，如主栽品种单一、缺少不同熟期的优良品种，导致成熟期过于集中，果品供应周期短；良种化程度低，果个小、裂果重、单产低的品种仍占较大比例；优良品种奇缺，具有自主知识产权的品种非常少，引进品种存在种植区域和管理技术方面“水土不服”的问题，造成了种植户的高投入，低回报，未能发挥甜樱桃“小水果（面积小），高效益（价格高）”的优势；优良新品种培育难度越来越大，必须寻求育种技术的创新与突破；为促进甜樱桃产业健康长远发展，满足旅游观光、采摘的需求，全面提升甜樱桃产业的市场竞争力，培育优质甜樱桃新品种势在必行。利用传统育种方法培育新品种需要20~30 年，育种周期长，因此，开展甜樱桃高效育种技术研究，建立现代高效育种技术，培育具有自主知识产权的突破性甜樱桃品种，对提升樱桃产业市场竞争力，促进樱桃产业健康可持续发展具有重要意义。

河北省农林科学院昌黎果树研究所樱桃与生物技术研究室从2000 年开始进行甜樱桃新品种培育技术研究，建立了甜樱桃“三早二选一促”的高效育种方法，其中“三早”即早获得杂交苗的方法（甜樱桃胚抢救技术体系建立，甜樱桃体细胞胚发生技术体系建立和甜樱桃快速播种当年成苗技术建立）；“二选”即利用自交亲和性状分子标记辅助筛选技术和质构分析筛选技术尽快筛选出优质并符合育种目标的杂交后代；“一促”即利用砧木、整形修剪、促控药剂等缩短甜樱桃实生苗童期技术。将育种周期缩减了3~5 年，大大提高了育种效率，并利用该方法培育出了7 个甜樱桃新品种。

1 “三早”——三种杂交（实生）苗早获得的3 种方法

1.1 甜樱桃胚抢救技术体系建立 以红灯与斯特拉的杂交胚为试材，研究了甜樱桃幼胚的最佳抢救时期是在30 d 以后进行，并筛选出适宜的胚萌发培养基、新梢增殖培养基、生根培养基[1]。

建立了甜樱桃胚抢救技术程序：取花后30~45 d果实种子→砸破外种皮→酒精浸泡30 s→无菌水冲洗2 次→0.1%升汞消毒7 min→去内种皮→84 消毒液浸泡20 min→接种，胚萌发培养基（MS+0.4 mg/L IAA+1.0 mg/L BA）→植株形成→继代，新梢增殖培养基（MS + 0.4 mg/L IAA +0.7 mg/L BA→生根（1/2MS +0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L IBA）→驯化移栽。

最佳驯化移栽方法为将生根苗移至温室后，先遮荫，再逐渐增加光强，30 d后，开口炼苗7 d再移栽，此时生根苗叶片浓绿，肥厚，苗粗壮，茎呈红褐色，半木质，主根为浅红色，有白色侧根，移栽成活率达95%。

1.2 甜樱桃体细胞胚发生技术体系建立 以甜樱桃‘红灯’ב斯特拉’，未成熟幼胚子叶为试材，研究了胚性愈伤组织的诱导及继代培养、体细胞胚发生及植株再生等培养条件[2]。研究了不同基因型体细胞胚胎发生的差异：对花后30~45 d 的红灯、红艳、先锋、拉宾斯、短枝斯特拉、斯特拉、短枝斯特拉×红灯共7 个不同基因型幼胚进行体细胞胚发生诱导，诱导成功率分别为90.5%、72.5%、59.5%、53.8%、59.5%、29.8%、27.4%。从以上数据看，不同基因型间的体细胞胚诱导存在很大差异，其中红灯和红艳两个早熟基因型的诱导率较高。

建立了甜樱桃体细胞胚发生技术程序：取杂种幼胚→0.1%升汞消毒7 min→去内种皮接种→84 液消毒20 min→去胚芽→愈伤组织诱导（MS+2.0 mg/L 2,4-D +1.0 mg/L BA +40 g/L 蔗糖+5.0 g/L 琼脂）→体细胞胚诱导（MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L BA+40 g/L蔗糖+5.5 g/L 琼脂）→胚体成熟及植株再生（1.0 mg/L 6-BA+MS+0.1 mg/L NAA）→继代培养（0.5 mg/L 6-BA+MS+0.2 mg/L NAA）→生根（1/2MS+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L IBA）→驯化移栽。

1.3 甜樱桃快速播种当年成苗技术建立 开展了从选种、种子预处理、种子液体培养、播种到出苗的适宜条件筛选，研究建立了甜樱桃快速播种当年成苗技术程序：3 月下旬，选择温室刚成熟的自然授粉甜樱桃品种‘早大果’，‘红灯’、‘玲珑脆’和‘甜心’等，取无病虫害的果实，将果肉与种子剥离，装入干净的烧杯，用自来水洗净，去除漂浮在水面上的种子（败育），将沉在水底的种子取出，砸破外种皮，取出种仁（保证种仁完整），将其放在三角瓶中，用蒸馏水冲洗干净，并用蒸馏水浸泡，盖上封口膜，置于2~6 ℃冰箱冷藏1~2 d，取出浸泡后的种仁置于培养皿中，用手术刀片去除内种皮，放入盛液体培养基（不含琼脂的MS，1.0 mg/L BA、0.2 mg/L IAA）的三角瓶中进行培养，封口并置于4 ℃冰箱冷藏，3 d 换1 次培养液，培养6 d 后播种；5~7 d 后，陆续有芽露出土面，待植株长到10~15 cm，5 月中下旬将培养成株的实生苗定植田间，10 月可长成0.8~1.0 m 的成苗。次年进入选种圃，进行选种。

利用这3 种方法提早、高效获得杂交（实生）后代，从而缩短育种周期。

2 “二选”——两种杂交（实生）后代筛选技术

2.1 自交亲和性状分子标记辅助筛选技术 研究了CTAB法提取甜樱桃总DNA的方法[3]：取嫩叶2~3 片，液氮研磨后转入2 mL 离心管中，加入0.9 mL 2%CTAB 提取缓冲液（5 mol/L NaCl，0.25 mol/L EDTA，1 mol/L Tris-HCl pH8.0，2%PVP 和0.1%DIECA），置于65 ℃保温30 min，冷却至室温，加入等体积CI（chloroform∶octanol=24∶1)，12 000 rpm 16 ℃离心15 min，取上清，加入等体积CI 洗涤离心2 次，2/3 体积异丙醇沉淀，弃上清，乙醇清洗晾干，加入200L TE（pH8.0）缓冲液溶解。

引物BFP200/ BFP201 与内对照引物PCR IC-F/IC-R 的反应体系为15L：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTPs，2 mmol/L MgCl2，0.2mol/L 引物BFP200/ BFP201，0.1mol/L引物IC-F/IC-R，1.5 UTaq DNA 聚合酶，约20 ng DNA模板。PCR 反应条件：94 ℃3 min，94 ℃45 s，50 ℃1 min，72 ℃1 min，35 个循环，72 ℃延伸10 min；PCR 体系2 反应条件:94 ℃3 min，94 ℃45 s，50 ℃1 min，72 ℃1 min，35 个循环，72 ℃延伸10 min。PCR 产物在2%琼脂糖凝胶(含0.5g/mL EB)上进行电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，5 V/cm 电压电泳40~60 min，紫外灯下成像并拍照。

筛选程序为：甜樱桃实生苗嫩叶→提取总DNA→PCR→2%琼脂糖凝胶→自交亲和性状确定→田间套袋自花结实率验证。

利用该方法可在苗期对杂交后代是否具备自交亲和性状进行鉴定，有利于自花结实后代的早期筛选，提高育种效率。

2.2 质构分析快速筛选技术 质地特性是樱桃果实极其重要的品质因素，物性分析仪所反映的主要是与力学特性有关的果蔬质地特性，具有较高的灵敏性与客观性。主要测试果实的成熟度、坚实度、果肉硬度、果实的脆性及果皮或果肉的弹性等。TPA 测试法是通过探头的二次下压全面的反映水果的硬度、脆性、弹性、内聚性、回复性、咀嚼性等。经过反复测试及调整优化，筛选出了适于甜樱桃的参数设置：探头P50，模式为TPA，测试前、测试及测后速率均为1 mm/s，压缩程度25%，停留间隔为2 s，触发力为0.1 N。

利用该技术可快速准确测定果实硬度，进行硬肉、耐贮品种筛选。

3 “一促”——杂交（实生）后代缩短童期、促早开花技术

在樱桃新品种培育过程中，实生苗从种植到开花、结果一般需要3~4 年时间，严重影响育种进度。我们在生产实践中总结出一套利用喷施促控药剂，结合刻芽、掐尖、扭稍等栽培管理措施，促使缩短实生苗童期，第2 年就可以开花、结果，有利于优系的早期筛选，可以缩短育种周期2~3 年。

4 总结

利用甜樱桃“三早二选一促”的高效育种方法，克服了传统育种方法中育种周期长、育种效率低的问题。通过早期筛选技术，将不符合育种目标的单株尽早淘汰，结合促早结果技术，缩短实生苗童期技术，缩短育种周期，提高育种效率和准确率。利用该方法已培育出‘玲珑脆’、‘五月红’、‘早蜜露’、‘昌华紫玉’、‘昌华紫脆’、‘昌华紫霞’和‘晚蜜露’共7 个甜樱桃新品种。