射血分数保留型心力衰竭动物模型的研究进展

李慧颖，缪 荣，肖湖南，白永怿，刘宏斌

1 解放军总医院第二医学中心 心血管内科，国家老年疾病临床医学研究中心，北京 100853；2 解放军医学院，北京 100853；3 北京卫戍区朝阳第六离职干部休养所 门诊部，北京 100027

自2016 年美国心脏病学会和欧洲心脏病学会将心力衰竭(以下简称心衰)分为射血分数减低型心 衰(heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF)、射血分数中间值的心衰(heart failure with mid-range ejection fraction，HFmrEF)和射血分数保留型心衰(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)以来，HFpEF 的发生率逐年增加，已发展成为心衰的最主要类型，临床上半数以上的心衰为HFpEF[1]。起初人们认为HFpEF 是以高血压、心肌肥厚和舒张功能障碍为特征的循环功能障碍，而目前来看，HFpEF 综合了心、肺、血管、肾、脂肪组织、骨骼肌、免疫和炎症等多系统功能紊乱[2-3]，有高血压、心肌缺血、肥胖、糖尿病、血脂异常和衰老等方面的病因[4]。由于复杂的病理生理学特点、表型异质性和自然发病史，HFpEF 的治疗一直无较大突破[5]，而建立符合人类HFpEF 发病机制的动物模型成为揭示新的信号通路和潜在治疗靶点的关键。本文将从压力负荷相关动物模型、缺血模型和代谢功能障碍模型方面对HFpEF 实验动物模型的建立进行综述，为实验动物模型的选择提供参考。

1 压力负荷相关HFpEF 动物模型

早期的HFpEF 模型多模拟压力负荷机制，这类模型动物的收缩压升高，心脏后负荷增加，心肌肥厚且纤维化，心室舒张功能降低，心肌血流储备受损，其早期左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)基本在正常范围，虽然压力负荷模型后期难免转为HFrEF，但此类模型体现了HFpEF 的基本病因，再联合其他要素则更贴合实际的HFpEF。常见的压力负荷模型有Dahl 盐敏感(Dahl salt-sensitive，Dahl/SS)大鼠模型、自发高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)模型、主动脉缩窄(transverse aortic coarctation，TAC)模型、肾性高血压模型、激素相关的压力负荷模型等。

1.1 Dahl/SS 大鼠 Dahl/SS 大鼠由SD 大鼠近亲繁殖而来[6]，是遗传性高血压大鼠，同时也是常用的心衰动物模型。糖酵解代谢增强、氧化解偶联异常、细胞外基质的改变、动脉内皮功能和心肌血流储备受损、细胞凋亡增强是其发生HFpEF 的机制[7]。该方式无须手术，主要优点是能够模拟HFpEF 患者压力负荷下发病的慢性进程，缺点是容易转为HFrEF[8-9]，需要经胸超声或介入手段监测心脏功能障碍的变化。建模方法简单，正常饮食(0.3%氯化钠)喂养Dahl/SS 大鼠至7 周龄，而后转用高盐饲料(8%氯化钠)喂养至13～14 周龄可建立HFpEF 模型[10-11]，此时心脏超声证实其心肌肥大，舒张功能障碍，而左心室容量、LVEF未发生变化。此类模型适于HFpEF 心肌纤维化、室性心律失常、内皮功能障碍、炎症等方面的研究[11-15]。

1.2 SHR SHR 是Wistar-Kyoto(WKY)高血压大鼠的近交系，高血压自发率100%，是常用的原发性高血压及心衰的啮齿类实验动物[16]。从4～6 周龄开始，SHR 血压逐渐升高，最高可达180～220mmHg (1mmHg=0.133)，16 周以后高血压的相关并发症形成，并且出现HFpEF 的心脏结构特点[17]，28～51周龄的衰老SHR 大鼠的舒张功能障碍发生进展性改变，而左心室收缩功能保留，52～53 周龄的SHR 大鼠其心内膜下胶原合成和沉积明显增加，心电图体现心肌缺血[18]。Holjak等[16]对SHR 种群建立近60 年来的表型改变进行了系统评价，认为目前的SHR 品系较以往世代能更好地模拟HFpEF 向心性肥厚的特点，适于相关的药理学研究。但该模型对温度、湿度、清洁度、光照等饲养环境要求严格，最初4～6 周不应给予任何应激刺激，乳鼠可饲喂用鸡蛋和奶粉做成的蛋糕，后续饲养过程中也要防止肺部感染。

1.3 TAC 相关模型 TAC 诱发高血压心肌肥厚和心衰的方法始于1991 年，通过在主动脉弓部用线结扎法形成精确的定量缩窄，达到限制血流、增加室内压的目的。成模过程以小鼠为例，选用9～10 周龄雄性小鼠，重度缩窄(28 G)后2～3周即可发展为心衰，中度缩窄(27 G)后4～6 周也可以发展为心衰[19]；缩窄部位也可选用腹主动脉等部位[20]。目前TAC 与醋酸去氧皮质酮(deoxycorticosterone acetate，DOCA)慢性刺激共同诱导的小鼠模型较多地用于基础研究[21-23]。此类模型早期呈现向心性肥厚和舒张功能障碍，心肌血流储备减少、冠状动脉内皮功能减弱、能量代谢异常，后期亦会发生心室扩大、室壁变薄和射血分数减低，故术后应及时、定期地进行心脏超声等监测。Wallner 等[24-25]对2 月龄雄性美国短毛猫的主动脉进行部分结扎，持续压力负荷4 个月后呈现HFpEF 特点，并有NT-proBNP 水平升高、肺动脉高压和肺功能受损，更好地体现了HFpEF 的心肺功能特征。该方法也可用于建立小型猪等大型动物的HFpEF 模型。

1.4 肾性高血压模型 由Page[26]最早提出的肾外包绕是常用的肾性高血压建模方式，建模方法为手术准备并钝性分离动物肾以后，用玻璃纸、乳胶薄膜、丝绸、火棉胶等材料绕肾门将肾交叉包绕。肾外包绕引起肾周围炎，在肾外逐渐形成一层纤维素鞘膜，压迫肾实质，造成肾缺血，激活肾素-血管紧张素系统，进而引起血压升高和舒张功能障碍。建模时可对模型动物进行单侧或双侧肾包绕，模型动物可选用鼠、猪、犬甚至灵长类动物等[27]。Munagala 等[28]率先用此模型进行了针对HFpEF 的大动物研究，研究表明双侧肾包绕导致老年犬的动脉僵硬度增加，并且与左心室质量增加和纤维化有关。此类模型进展较慢，适合长时间深入的以及衰老相关因素的研究。此外有单侧肾全部或部分切除的造模方式，如Primessnig等[29]切除雄性Wistar 大鼠单侧肾大部(5/6)建立慢性肾功能不全和HFpEF 模型，此外也有造成肾动脉狭窄的肾性高血压建模方式[30]。该类模型左心室肥大，左心室松弛时间常数延长，左心室舒张末期压力增加，肺质量增加(肺淤血)，NT-proBNP 增加，左心室收缩功能保留，符合HFpEF 的临床特点，但手术操作相对复杂。

1.5 激素相关的压力负荷模型

1.5.1 单纯激素诱导的压力负荷模型目前较少应用 肾上腺素对心脏β 肾上腺素能受体的长期慢性刺激以及血管紧张素/盐皮质激素对血管平滑肌、水钠平衡的长期影响是此类模型的建模机制。早期Mori 等[31]通过皮下埋植微量渗透泵释放血管紧张素Ⅱ[1.5 mg/(kg·d)]或苯肾上腺素[40 mg/(kg·d)]的方式，使得9 周龄雄性C57BL/6 小鼠出现向心性肥厚和舒张功能障碍，而其收缩功能正常；其研究表明激素通过cyclin-CDK/Rb/E2F 信号通路引起丙酮酸脱氢酶激酶4 上调进而抑制葡萄糖氧化可能是HFpEF 的发病机制之一。另有研究采用皮下释放低剂量AngⅡ[0.2 mg/(kg·d)]的方法来建立前临床阶段的HFpEF 小鼠模型[32]。

1.5.2 激素联合其他压力因素可加速诱导HFpEF模型 激素联合其他因素可加快成模时间，如上文提到的DOCA 与TAC 共同诱导的动物模型，又如DOCA 联合单侧肾切除并给予等渗盐水加速压力负荷的啮齿类动物模型等[27]。盐皮质激素DOCA通常通过皮下埋植微量渗透泵的方式给药，联合其他压力负荷因素可使模型动物加速呈现心脏肥厚和纤维化、E/E’升高、等容松弛时间常数增加等舒张功能障碍。

1.5.3 激素联合代谢因素可更好地模拟HFpEF 的临床特征 给予长白猪DOCA(100 mg/kg) 90 d，同时给予其“西方饮食”(高盐、高脂肪、高胆固醇、高糖)，可诱导建立HFpEF 大动物模型[33-34]。后续又有DOCA 和西方饮食基础上联合Ang Ⅱ(0.015 mg/h，微量泵)建立的成年雌性长白猪模型[35-36]以及DOCA 和西方饮食诱导的雌性哥根廷小型猪模型[37]等。这种激素联合其他因素诱导的方式可在压力负荷的基础上模拟代谢综合征因素，与临床上HFpEF 多器官疾病共存的特点更相符，对啮齿类动物同样适用。

2 缺血模型

通过各种方式造成心肌缺血的动物模型可在一定程度上模拟HFpEF 的病理特征。上文提及的肾上腺素诱导法即可导致心肌耗氧增加和心肌相对缺血[38]，激素诱导的缺血模型可操作性强，周期短，大小型动物均适用，但不能精确定位梗死区域，与临床心肌缺血有一定差异。冠状动脉结扎法可模拟大鼠等动物的心肌缺血。中大型动物可利用Ameroid 缩窄环套于其冠状动脉外、冠状动脉左前降支内注入微栓塞球、左心室内注射月桂酸钠等方式来构建缺血模型[39]。上述动物模型操作复杂、造价高、死亡率高，且常发展为HFrEF，可用于HFpEF 心肌缺血亚型的建模。

3 代谢综合征模型

糖尿病、高血压、肥胖、高脂血症以及肺、肾等器官的功能不全常同时存在，在此基础上发展而成的HFpEF 一定是多种因素促成的，近年来HFpEF 动物模型逐渐向代谢综合征方向发展。

3.1 高脂血症、肥胖和糖尿病模型能够体现HFpEF 的代谢特点

3.1.1 高脂血症和肥胖模型 脂质堆积和肥胖与高血压、心肌缺血、心肌代谢紊乱密切相关。薛礼美等[40]尝试利用HFD 喂养新西兰白兔3 个月建立HFpEF 模型，此造模方法简单，但历时长，且病理变化程度不易控制，故有研究先用HFD 引起高脂血症，而后联合其他方式诱导HFpEF。如HFD 喂养SHR 大鼠构建高血脂合并高血压的HFpEF 模型，又如HFD 联合链脲佐菌素腹腔注射破坏胰腺构建高血脂合并糖尿病HFpEF 模型。事实上，HFD 引起的脂代谢紊乱和胰岛素抵抗是HFpEF 的基础病理特点，单纯高脂血症模型应用较少。

3.1.2 肥胖和糖尿病模型 糖尿病和胰岛素抵抗状态会增加氧化应激、促进微血管功能障碍以及炎症反应，进而引起心脏结构和功能的改变，此为HFpEF 发生的重要机制[41-42]。一些基因敲除小鼠，如瘦素缺陷型ob/ob 小鼠以及瘦素受体缺陷的db/db 小鼠，既存在摄食过量、肥胖、高血糖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗的特征，又存在HFpEF 的病生理特点。db/db 小鼠9 周龄开始呈现出左心质量和室壁厚度增加的特点，同时伴有活性氧产生增加、心肌间质纤维化，类似于糖尿病心肌病；5 月龄呈现出左心室舒张压最大下降速率下降的特点，此时经胸心脏超声可以证实其心脏收缩功能保留，而等容舒张时间延长，E/A 下降，与舒张性心衰的特征一致[43]。Monma 等[44]发现20 周龄的db/db 小鼠e’、E/e’、舒张末期压力容量关系、左心室松弛时间常数等舒张功能相关指标皆较同窝出生的对照组仔鼠(db/+)恶化，但其射血分数保留。ob/ob 小鼠也是一种肥胖和糖尿病动物模型，其左心室舒张功能发生障碍，E/A 下降，但可能发展为糖尿病心肌病。Zucker 大鼠是肥胖和高血压的遗传模型，包括瘦型和肥胖型两个亚系，其中肥胖型Zucker 大鼠(不能表达瘦素受体)的特点类似于人类肥胖和2 型糖尿病早期阶段，且其左心室质量和舒张功能障碍持续加重，左心室等容舒张时间延长，类似HFpEF 的特点。另外Zucker 肥胖糖尿病(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠是肥胖型Zucker 大鼠中能够发展为严重Ⅱ型糖尿病的大鼠，常合并轻度高血压，左心室质量增加不甚显著，但存在舒张功能障碍；日本大冢黄褐鼠德岛肥胖(Otsuka long-evans tokushina fatty，OLETF)大鼠等糖尿病模型[45-46]亦与HFpEF 特征相似。

3.2 ZSF1 大鼠是常用的HFpEF 代谢综合征模型ZSF1 动物模型建立在上述Zucker 糖尿病大鼠之上，为目前流行的HFpEF 动物模型[47-49]。它由Zucker 糖尿病肥胖大鼠与自发高血压心衰大鼠(由SHR 与瘦素受体基因突变的肥胖型SHR)交配而来。5 月龄的ZSF1 大鼠综合了肥胖、高血压、高脂血症、左心室肥厚和舒张功能障碍、左心房扩张、心肌纤维化、肾功能障碍、NO 信号通路减弱、大动脉硬化、运动不耐受、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)升高等与人类颇为相似的特点，且其LVEF 保留[49-50]。雄性与雌性ZSF1 大鼠均可呈现类似HFpEF 的心脏功能障碍[51]，Goto 等[52]研究发现，雌性ZSF1大鼠、雌性Dahl/SS 大鼠以及雄性TAC/DOCA 诱导的小鼠都能体现LVEF 相对“保留”、左心室舒张末期内径增大和E/e’增大等特点，但32 周龄的雌性ZSF1 大鼠与人类HFpEF 重合度更高，体现在其骨骼肌组织与人类HFpEF 患者在肌萎缩相关蛋白标志物表达(泛素蛋白酶体系统中的肌肉特异性环指蛋白1 以及自噬信号通路中的蛋白LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值)、线粒体代谢(琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、孔蛋白表达)方面特征类似，而另外两类模型动物则不能呈现出这些人类组织相似点。Franssen 等[53]的研究发现，ZSF1 肥胖大鼠与人类HFpEF 都存在冠状动脉微血管内皮细胞的激活和氧化应激。因此在研究HFpEF 运动不耐受特征的骨骼肌表现、心脏微循环代谢、线粒体代谢等生理机制时更倾向于用此模型。

3.3 HFD 与NOS 抑制剂共同诱导的“双重打击”模型迅速流行 2019 年Schiattarella 等[54]阐述了一种新的HFpEF 造模方法，他们利用HFD(60%脂肪功能)和充足的Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(Nω-nitro-L-arginine methylester hydrochloride，L-NAME)饮水(0.5 g/L)，使得C57BL/6N 小鼠模拟了HFpEF 的众多代谢特征：HFD 导致体质量增加、糖耐量下降；L-NAME 为NOS 抑制剂，会引起内皮功能障碍性血压升高、动脉僵硬度增加、冠状动脉内皮功能受损、冠状动脉血流储备减少。HFD + L-NAME 组模型小鼠有心肌肥大、心肌纤维化、心脏舒张功能恶化并伴有肺充血，甚至运动耐量下降的特点，非常接近真实的HFpEF。事实上，L-NAME 更多地抑制了模型动物 的 内 皮 型NOS(endothelial NOS，eNOS)，其iNOS 的转录和蛋白水平反而有所上升，而HFpEF 患者和ZSF1 肥胖大鼠也有心血管系统iNOS 水平的升高。Schiattarella 等[54]利用此模型揭示了iNOS 诱导的IRE1α-Xbp1s 通路失调可能是HFpEF 的发病机制。此造模方式简单，成模时间短(5～15 周内HFpEF 表型得到展现)，模型稳定(超声心动图显示HFD + L-NAME 处理组的LVEF 保留时间长达1 年)。陈骁楠等[55]参照此方法建立了HFpEF 模型，他们给予8 周龄雄性和雌性C57BL/6J 小鼠60%高脂饮食以及0.5 g/L 的L-NAME 饮水，16 周龄模型小鼠组的E/A 比值、E/E'比值和左心室整体长轴应变均较同性别对照组高，24 周龄模型组小鼠的LVEF 仍与对照组保持一致，且呈现出心肌细胞肥大、心肌间质纤维化和左心室重构的基本特征。此动物模型的缺点是不能模拟HFpEF 患者高容量和高盐负荷的特点，进行相关机制研究时应注意NOS 抑制剂在促进内皮功能障碍和炎症因素的同时打破了氧化与亚硝基化的平衡。

3.4 HFD 联合衰老和压力因素的“多重打击”模型可更好地模拟HFpEF 的慢性发病机制 Deng 等[56]高脂饮食喂养3 月龄小鼠13 个月，并在最后1 个月时向其腹腔内注入去氧皮质酮新戊酸酯(DOCP，75 mg/kg)来加速高血压和系统炎症，从而建立高脂、衰老和盐皮质激素“三重打击”HFpEF 模型。此模型呈现病理性心肌肥厚、舒张功能不全、高血压、内皮依赖性血管舒张功能减弱、氧化应激和炎症反应增加、运动耐量下降、胶原沉积增加、间质纤维化增加、肺质量增加、回心血量下降、心排血量下降等特点，但其LVEF 维持不变；该团队利用此模型证实β 羟基丁酸能够减少NLPR3 炎性小体的生成、减轻线粒体高度乙酰化、改善HFpEF 心肌纤维化。Withaar等[57]于2021 年建立了高脂-衰老-血管紧张素Ⅱ“三重打击”模型，即给予18～22 月龄的老年C57BL/6J 小鼠HFD 3 个月，同时在给予HFD 的最后1 个月经皮下微量渗透泵给予血管紧张素Ⅱ[1.25 mg/(kg·d)]，从而使小鼠表现出HFpEF 的特点；该团队利用此模型探究了利拉鲁肽和达格列净对HFpEF 的药用价值。融合了衰老因素的模型喂养时间长，但适合血管内皮和微循环、炎症、心肌重塑和衰老相关病理机制的研究。

4 结语

压力负荷是经典的HFpEF 造模方式，但单纯高血压心肌肥厚不再是最常见的HFpEF 表型，压力负荷联合肥胖、糖尿病等代谢因素的复合模型更优；代谢功能障碍模型更贴近HFpEF 的特征，是目前主要发展方向。不同阶段的HFpEF 生物学表现差异显著，目前没有任何一种模型能够完美模拟人类HFpEF 的发生、发展进程，研究者应结合研究目标选用相应的诱导方式以得到合适表型。HFpEF 治疗相关的研究应在不同的动物模型中均有效，包括一些与人类更贴近的大动物模型。