无乳链球菌荚膜多糖疫苗的研究进展

陈 晶，范钊玮，马 骏，崔玉东

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)也称为B族链球菌(Group B Streptococcus，GBS)，是一种人兽共患性机会致病菌，最初从乳腺炎患牛中分离而得，是引起奶牛亚临床乳腺炎的最常见病原菌[1-2]。并可在健康成年人的胃肠道以及泌尿生殖道内无症状定植[3-4]。新生儿感染可导致危及生命的败血症以及脑膜炎的发生，并常伴有严重的神经系统后遗症[5-7]。孕产妇群体被确定为S.agalactiae的主要传播者，妊娠相关的S.agalactiae感染可导致流产、死产以及早产等不良妊娠结局。此外，阴道内的S.agalactiae可通过上行感染侵入羊水和胎膜，粘附于胎儿体表，或被胎儿吸入体内，也可在分娩期间新生儿流经产道时接触或吸入受污染的羊水或阴道液而发生传染[8-9]。在没有任何干预的情况下，S.agalactiae携带者所生的新生儿中约有50%被S.agalactiae定植，其中1%～2%的婴儿患有侵入性疾病[10-11]。

鉴于妊娠相关的S.agalactiae感染对新生儿造成巨大威胁[12]。人们一直致力于通过筛查并治疗孕产妇S.agalactiae感染来缓解对新生儿造成的危害。产时抗生素预防(Intrapartum antibiotic prophylaxis，IAP)策略的实施虽降低了新生儿S.agalactiae感染早发性疾病(Early-onset disease，EOD)的发病率[13]，但并不能预防晚发性疾病(Late-onset disease，LOD)的发生[14-15]。并且，对于1周岁以上的儿童及成年人目前仍未找到有效的S.agalactiae感染预防策略。目前，国内外主要采用青霉素等β-内酰胺类抗生素作为治疗S.agalactiae感染的首选药物。虽然抗生素治疗可部分缓解症状，但对青霉素、红霉素、四环素以及克林霉素等抗生素具有耐药性的菌株已大量出现[16-19]，使得抗生素治疗的有效性逐步下降。此外，抗生素的频繁使用必然会导致机体的菌群失调以及随之而来的多种疾病的易感性增加。目前，许多研究已经观察到实施IAP的孕妇所生新生儿肠道菌群遭到破坏，并在部分新生儿体内分离到具有耐药性的S.agalactiae菌株[20-21]。另有一些新生儿由于疑似EOD而被错用抗生素[22]。

有效的S.agalactiae控制计划应更多依赖于预防而不是治疗。接种疫苗无疑是预防S.agalactiae感染最安全有效的策略。鉴于S.agalactiae感染对新生儿造成的严重不良影响，2015年世界卫生组织疫苗产品开发咨询委员会会议上将开发S.agalactiae母体疫苗确定为高度优先事项[23]。据估计，全球高覆盖率(90%)的有效S.agalactiae母体疫苗(>80%)每年可预防231 000例婴儿和产妇S.agalactiae病例、41 000例死产以及66 000例婴儿死亡[24]。到2040年，对怀孕期间以及青春期接种S.agalactiae疫苗的需求或将超过2.2亿剂[25]。然而，至今仍未有获得许可的安全有效疫苗。

1 无乳链球菌的荚膜多糖

S.agalactiae的荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)是重要的毒力因子，在唾液酸转移酶的作用下与唾液酸结合形成唾液酸化的CPS[26]，可避免被宿主细胞的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)识别，从而实现免疫逃避[27]。还可通过增强生物膜形成改变或覆盖表面抗原，从而有效躲避宿主的识别，并可抑制抗菌肽和中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps，NET)的结合以及影响细菌对上皮细胞和粘液的粘附来增加侵袭性[28-29]。CPS缺陷的S.agalactiae菌株毒力明显减弱。依据CPS的不同，S.agalactiae目前被划分为10个血清型(Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII，VIII、IX)[30-32]。虽然所有血清型的S.agalactiae都可引起侵袭性感染，但引起疾病的主要血清型在各地有所不同，并因侵袭性和定殖性而异，而其中的5种血清型(Ia、Ib、II、III和V)在感染病例中居多[33-34]。

2 无乳链球菌的荚膜多糖疫苗

作为S.agalactiae最重要的毒力因子之一，CPS一直是研发S.agalactiae疫苗的主要靶标。早在20世纪30年代，就有研究表明注射CPS特异性多克隆兔血清可以保护小鼠免受S.agalactiae的致命攻击，这是S.agalactiae特异性抗体具有保护性的第一个证据[35]。1976年，Baker和Kasper提出孕妇接种疫苗是预防新生儿S.agalactiae感染的一种有效策略，母体内III型CPS的抗体水平与新生儿对S.agalactiae的敏感性密切相关，母体的CPS抗体能够透过胎盘传递给胎儿，从而保护新生儿免受S.agalactiae感染[36]。20世纪80年代，CPS疫苗在包括孕妇在内的健康成年人身上进行了临床试验，虽然Ia、II和III型CPS疫苗均具有良好的耐受性，但其免疫原性较差，特别是Ia型和III型CPS仅在约50%的受体中显示出免疫反应，且产生的抗体水平较低[37]。在小规模的孕妇临床试验中CPS疫苗表现出良好的安全性，并且新生儿脐血抗体水平与分娩时母体抗体水平直接相关，进一步证实了母体免疫的可行性，但免疫原性仍不理想[38]。并且，单一血清型的CPS疫苗通常不能对其他血清型的S.agalactiae菌株发挥交叉免疫保护作用。2014年，在世界卫生组织召开的疫苗产品开发咨询委员会第一次会议上，确认S.agalactiae的CPS疫苗因免疫原性差而无效[39]。

3 无乳链球菌的荚膜多糖蛋白结合疫苗

CPS的免疫原性可通过与载体蛋白结合而增强。近期预防新生儿S.agalactiae感染的新措施，主要集中于孕妇接种S.agalactiaeCPS蛋白结合疫苗，不仅可以血清型特异性的方式降低新生儿和婴儿的疾病风险。此外，由于蛋白质可能存在于不同的血清型中，S.agalactiae的CPS蛋白结合疫苗有可能提供跨血清型的广泛保护。

3.1 TT载体疫苗 早期的CPS蛋白结合疫苗以破伤风类毒素(Tetanus toxoid，TT)作为载体。在动物模型中，多种血清型的CPS(Ia，Ib，II，III，IV，V，VI，VII和VIII)与TT结合制备而成的CPS-TT结合疫苗显示出比CPS疫苗更高的免疫原性[40-44]。首次人体临床试验是将纯化的III型CPS与TT偶联(III-TT)，免疫接种非妊娠妇女获得了比III型CPS更好的免疫效果，并且免疫原性呈现剂量依赖性[45]。孕妇接种III-TT疫苗后，婴儿脐带血中保护性IgG水平升高，并且与母体抗体水平直接相关[46-47]。进一步将5种最常见的致病血清型CPS(Ia，Ib，II，III和V)分别与TT结合制备CPS蛋白结合疫苗，在健康女性中进行了I期和II期临床试验，所有结合疫苗的免疫原性均得到了一定程度的提高，诱导了具有功能活性的血清型特异性IgG，在补体存在的情况下，能够在体外实验中增强人外周血白细胞对S.agalactiae的杀伤作用[48-51]。

为应对更广泛的GBS血清型，进一步开发了几种多价疫苗。虽然II-TT和III-TT二价疫苗并未引起比单价疫苗更强的抗体应答，但免疫血清对Ⅱ型和Ⅲ型S.agalactiae的体外杀伤均有促进作用[52]。4种血清型(Ia，Ib，II和III)CPS的多价TT结合疫苗接种小鼠以及健康成年人均诱发了更强的抗体水平[53]。2017年开始了针对血清型Ia、Ib、II、III和V的S.agalactiaeCPS结合疫苗的临床试验。虽然与TT相连提高了CPS的免疫原性，但是在人体使用TT的一个重要问题是对载体预先存在的免疫，这很有可能会引起严重的不良反应。尽管目前进行的临床试验并未见严重不良反应的报道，但接种前12个月内曾接种破伤风疫苗被确定为该试验招募受试者的一条重要排除标准。

3.2 CRM197载体疫苗 另一种蛋白载体是从白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)C7 (β197)培养物中分离出的白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)的天然无毒突变体CRM197。CRM197无毒且具有更多的赖氨酰侧链可用于偶联，用作载体蛋白比TT更具优势。用TT和CRM197作为载体制备的CPS V型蛋白结合疫苗在健康女性体内引起的免疫应答并无明显差异，均能诱导比CPS疫苗更高的抗体水平[54]。葛兰素史克公司(Glaxo Smith Kline，GSK)开发的CPS三价(Ia、Ib和III)-CRM197结合疫苗可诱导非孕妇以及孕妇产生CPS特异性抗体，婴儿出生时即可检测到较高的CPS特异性抗体水平[55]，无安全问题，不影响婴儿对白喉类毒素和肺炎球菌疫苗的免疫应答[56]。进一步研究发现，提高免疫剂量、添加弗氏佐剂或进行第2次加强免疫并不能提高此疫苗的免疫效果[57]。调理吞噬作用是宿主清除S.agalactiae感染的主要机制。该临床试验的另一项研究结果指出，抗体介导的吞噬细胞对3种血清型S.agalactiae的杀伤作用在母体血清以及脐带血清中均显著增强。并且，被动转移至新生小鼠的脐带血清对小鼠防御3种血清型的S.agalactiae菌株均具有保护作用，且呈现剂量依赖性[58]。然而，该疫苗对于患有艾滋病的妇女免疫原性不佳，转移至婴儿的母源抗体水平也较低，无法对新生儿S.agalactiae感染性疾病提供足够的免疫保护[59]。有关加强免疫效果的研究显示，未怀孕女性初次免疫1个月后进行加强免疫，并未引起抗体水平的升高。然而，初次免疫4～6年后进行加强免疫可引起抗体水平增加200倍，即便是初次免疫后未检测到抗体的妇女在加强免疫后特异性IgG抗体水平也呈现显著性的升高[60]。

最近，鉴于血清型IV的S.agalactiae引起侵袭性疾病的增加，辉瑞公司(Pfizer)研制了一种6价CPS结合疫苗GBS6，由CRM197与6种CPS血清型(Ia、Ib、II、III、IV和V)组成，覆盖了98%的可引起侵袭性感染的S.agalactiae分离株[61]，已经进入I/II期临床试验(NCT 03170609)，用于评估该疫苗在18至49岁健康成人中的安全性、耐受性和免疫原性。该疫苗免疫接种小鼠与恒河猴可引起特异性IgG抗体水平的提高，免疫小鼠交配后所生的幼仔血清内同样具有较高水平的特异性IgG抗体，并且在感染S.agalactiae后具有88%～100%的高存活率(对照组幼鼠仅为1.5%～31%)。CPS特异性抗体的被动免疫同样可赋予幼鼠有效的免疫保护，受体鼠所生幼鼠感染S.agalactiae的存活率可达72%～100%[62]。2021年Judith Absalon和他的同事在Lancet Infect Dis报道了最新的临床试验结果，证实18至49岁非妊娠健康成年人对GBS6疫苗具有良好的耐受性，5 μg、10 μg以及20 μg的免疫剂量均可引起强烈的免疫反应，接种1周后S.agalactiae血清型特异性IgG水平升高，2周达到峰值，1个月内趋于稳定，随后呈现逐渐下降，但6个月时仍高于安慰剂组[63]。这项研究支持进一步在孕妇及婴儿进行免疫效果的评价。目前，I/II期临床试验(NCT 03765073)正在南非进行，将对18至40岁的健康非妊娠妇女、18至40岁的妊娠≥27周的健康孕妇及其婴儿的安全性、耐受性以及免疫原性进行评估。为了获得S.agalactiae疫苗的许可，还需要进行III期临床试验。

佐剂通常具有增强免疫原性的作用。迄今为止，只有一项研究给健康成人接种III型CPS-TT结合疫苗时添加了氢氧化铝作为佐剂。然而，该疫苗对CPS或破伤风组分均未显示出增强的免疫原性[64]。这一结果是出乎意料的，因为之前的动物试验表明，接种了含明矾的III型TT结合疫苗的小鼠和狒狒均表现出显著增强的免疫反应[65-66]。

4 荚膜多糖疫苗存在的问题

虽然CPS蛋白结合疫苗具有较好的免疫原性，并在一定程度上扩大了免疫保护范围，但仍然存在一些担忧与局限，包括载体的潜在免疫力对其他带有同种载体蛋白的结合疫苗，例如b型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟球菌与肺炎球菌结合疫苗以及白喉疫苗的免疫干扰。特别是血清特异性的问题仍未得到彻底的解决，多价CPS蛋白结合疫苗通常也只对疫苗中所包含的CPS类型或同源性较高的血清型提供保护，对无荚膜的或是新出现的荚膜血清型S.agalactiae菌株都无法提供有效的保护。世界范围内S.agalactiae血清型分布的变化要求不断的替换旧的血清型或添加新的血清型。

在开发可对S.agalactiae发挥广泛保护作用的疫苗研究中，人们发现菌体自身包含的保守性蛋白能够对多数S.agalactiae菌株产生免疫反应，不仅可直接作为疫苗抗原诱导机体产生保护性免疫应答，还可用作CPS结合疫苗的载体，在避免外源蛋白载体免疫干扰的同时又能够解决疫苗保护的广泛性问题，具有很好的应用前景。

利益冲突：无

引用本文格式：陈晶，范钊玮，马骏，等. 无乳链球菌荚膜多糖疫苗的研究进展[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：1001-1006. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.147