超声波辅助碱溶酸沉法提取藜麦麸皮蛋白及特性

孙永杰，赵阳，肖颖，王思妤

长春科技学院生命科学学院（长春 130600）

藜麦（Chenopodium quinoaWilld.）含有大量的优质蛋白质，联合国粮农组织（FAO）认为藜麦是唯一一种单体植物即满足人体基本营养需求的食物，正式推荐藜麦为最适宜人类的完美“全营养性食品”。

藜麦加工过程中产生大量的麸皮，其被遗弃而未得到合理的利用，造成大量资源浪费。近几年大多学者对于藜麦麸皮的研究集中在总皂苷的提取工艺或活性研究方面，但对藜麦麸皮中蛋白质的研究甚少，藜麦麸皮蛋白含量高达28.86%。试验采用碱溶酸沉的方法，优化藜麦麸皮蛋白的提取工艺及特性分析，为将来藜麦麸皮蛋白的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

藜麦皮（未粉碎），吉林省通榆藜麦种植基地；浓盐酸、氢氧化钠，学校实验室药品管理部门。

FPA-4（电磁力）电子分析天平（福州衡之展电子有限公司）；pHS-210实验室pH计（厦门和谱仪器有限公司）；HH.S21-Ni8恒温水浴锅（北京首易品科技中心）；KH20R实验用台式高速离心机（天津综科科技有限公司）；VAPODEST可编程蒸馏式全自动凯氏定氮仪（广州德资格哈特仪器有限公司）；上海昂尼AE300L-P/H/实验室高速剪切分散乳化机/分散均质机（南京昕仪生物科技有限公司）；HSCX800W超声波清洗机（济宁恒硕电子科技有限公司）；透析袋[中科瑞泰（北京）生物科技有限公司]。

1.2 工艺流程

藜麦麸皮→预处理→调pH→超声处理→离心→取上清液→调pH→离心→取沉淀→透析袋透析→离心冻干

1.3 操作要点

将藜麦皮过0.425 mm筛洗净，放在超微粉碎仪中粉碎，在35 ℃干燥，后置于干燥处密封备用。将处理好的麦麸皮，按照一定的料液比混合。用0.5 mol/mL的NaOH调节到碱性条件，放置在800 W的超声波清洗机中，设置好时间和温度，后将其放置到离心机中以4 000 r/min离心30 min，提取上清液，用0.5 mol/mL的HCl，调节到等电点，放置到离心机中以4 000 r/min离心30 min，收集沉淀，按一定的料液比溶于水中，调节pH 7.0，用透析袋脱盐36 h，每8 h换1次水，然后在4 ℃的条件下11 000 r/min离心冻干10 min，得到藜麦麸皮蛋白。

1.4 藜麦麸皮等电点的确定

在等电点时，蛋白质溶液的黏度、渗透压均减到最低，增加了蛋白质的沉淀。根据蔡沙等[5]确定的麸皮蛋白等电点的操作方法进行。量取270 mL上述麸皮蛋白提取液，平均分成9份，每份30 mL，分别依次调节pH至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，静置30 min左右，于10 000 r/min离心15 min，取上清液，分别测定其在595 nm处吸光度，上清液吸光度最小时对应的pH即为麸皮蛋白等电点。再以上述测得的等电点为粗等电点，以其对应的pH为中心，以0.1为单位，向前后扩散，再各取5个点，按照上述步骤用相同的方法测定这5个点的吸光度，最终测得吸光度最小的pH，即为麸皮蛋白的等电点。

1.5 单因素试验

以藜麦麸皮蛋白的得率为指标，对影响麸皮蛋白得率的因素[提取液的pH（10.0，10.5，11.0，11.5，12.0和12.5）、提取温度（35，40，45，50，55和60℃）、提取时间（25，30，35，40，45和50 min）和料液比（1∶12，1∶15，1∶18，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL）]进行单因素试验。在对某一个单因素进行试验时，必须保证其他因素的固定。

1.6 正交试验设计

根据单因素试验，选取每个影响因素3个较优水平，进行正交试验，见表1。

表1 正交因素表

1.7 麸皮蛋白的性质研究

1.7.1 乳化性和乳化稳定性的测定

称取12 g蛋白样品溶解于300 mL蒸馏水中，配制4.0%的麸皮蛋白溶液，加入大豆油，按体积比3∶1混合，采用高速分散器（20 000 r/min）均质1 min，取出60 mL备用。用加水稀释的方法依次配制3.5%，3.0%，2.5%，2.0%，1.5%和1.0%的麸皮蛋白溶液，并按照比例加入一定体积的大豆油，重复以上操作之后以1 500 r/min离心5 min，读取并记录乳化层高度，按照式（1）计算麸皮蛋白乳化性；同时量取10 mL上述乳化液于离心管中，于85 ℃水浴中恒温加热30 min，取出后再以1 500 r/min离心5 min，冷却放置30 min，后读取并记录乳化层高度，按照式（2）计算麸皮蛋白乳化稳定性。以上过程每个浓度重复3次，以平均值作为试验结果。

1.7.2 起泡特性的测定

蛋白质起泡特性包括起泡能力和稳泡能力，前者是指一定条件下产生泡沫的量，后者则指形成的泡沫稳定性。同样称取12 g蛋白样品溶解于300 mL蒸馏水中，配制4.0%的麸皮蛋白溶液，以20 000 r/min在高速分散器下均质1 min，迅速取出20 mL于25 mL量筒中，读取泡沫体积，用加水稀释的方法再配制3.5%，3.0%，2.5%，2.0%，1.5%和1.0%的麸皮蛋白溶液，并按照比例加入一定体积的大豆油，重复以上操作后放置30 min，读取泡沫体积，按照式（3）和（4）计算起泡性及泡沫稳定性。

1.7.3 溶解性测定

采用Bradford法测定蛋白样品的溶解性，制作标准曲线。称取5 g样品加入50 mL蒸馏水中，用0.5 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH溶液分别依次调节pH至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和12.0，不同的pH蛋白溶液分别在40，45，50，55和60 ℃下水浴30 min，然后取出，用玻璃棒搅拌30 min，在3 500 r/min的速率下离心15 min，取出上清液，加入5 mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，测定其在595 nm下的吸光度，查标准曲线得出含量，按照式（5）计算溶解性。

2 结果与分析

2.1 麸皮蛋白等电点结果分析

由表2可知，麸皮蛋白的初等电点为pH 3.0。由此可以测定麸蛋白更精确的等电点。结果如表3所示。

表2 麸皮蛋白的粗等电点

从表3可以看出，麸皮蛋白的等电点是pH 3.1。

表3 麸皮蛋白等电点

2.2 单因素结果分析

2.2.1 料液比对麸皮蛋白提取效果的影响

由图1可知，随着料液比的增加，提取效果呈现先增大后减小的趋势，这是因为随着料液比的增加，溶质的扩散速度也随之增加，并促进水溶性物质的充分溶出，导致提取物的含量升高，当扩散速度恒定时，料液比继续增加，提取物的浓度就会下降，提取物的纯度也会随之下降。当料液比1∶18 g/mL时，麸皮蛋白的得率达到最大值33.5%。

图1 料液比对麸皮蛋白提取效果的影响

2.2.2 pH对麸皮蛋白提取效果的影响

由图2可知：麸皮蛋白的得率随pH的增加呈现先缓慢增加后迅速降低的变化趋势，这是因为当pH为10.0～12.0时，碱溶度较低，蛋白质与淀粉分离不完全；当pH为12.0～12.5时，得率急剧下降，这是由于碱溶度过大，导致淀粉糊化，也容易使蛋白质发生变性；当pH为12.0时，得率最大，为23%。

图2 pH对麸皮蛋白提取效果的影响

2.2.3 温度对麸皮蛋白提取效果的影响

由图3可以看出：麸皮蛋白的得率受提取温度的影响较大，当温度在55 ℃之前，麸皮蛋白的得率不断增加，到55 ℃时达到最大值23%；温度继续上升，麸皮蛋白的得率就会不断地下降。通常情况下，温度过高会使溶液的黏度变大，分子的运动速度减慢，阻止蛋白质溶解到溶液中，同时由于疏水基团的暴露和展开，蛋白质分子凝集，使蛋白质溶解度下降，还有可能发生蛋白质变性，这些都可能导致蛋白得率下降。

图3 温度对麸皮蛋白提取效果的影响

2.2.4 时间对麸皮蛋白提取效果的影响

由图4可以看出，当反应时间在25～30 min时得率缓慢上升，在30～35 min时得率迅速上升，在35 min时得率达到最大值，在35～50 min时得率缓慢下降。因为麦麸中的一些碱性物质和其他物质溶出需要时间，所以随着反应时间的增加，麸皮蛋白的得率也会随之增大，但时间过长，这些物质又会发生共沉现象，导致得率降低。因此可以看出麸皮蛋白的得率随时间呈现先增大后减小的变化趋势，当提取时间35 min时，麸皮蛋白得率达到最大，为34.5%。

图4 时间对麸皮蛋白提取效果的影响

2.3 正交结果分析

从表4中的极差R比较可知，影响麸皮蛋白提取效率的因素的主次顺序为C＞D＞B＞A，即提取时间影响最大，提取pH次之。各因素理论最佳提取条件为A3B1C3D2，即料液比1∶25（g/mL），提取温度50 ℃，提取时间45 min，提取pH 11.5。而9次处理得到的最优组合为试验组7的A3B1C3D2，即料液比1∶25（g/mL），提取温度50 ℃，提取时间45 min，提取pH 11.5，与得出的理论最优组合一致。

表4 正交试验结果

2.4 麸皮蛋白特性结果分析

通过试验计算得出在麸皮蛋白溶液浓度为3%时具有最好的乳化性及乳化稳定性，同时得到乳化性的最大值69%，乳化稳定性是64%；当其浓度为3.5%时麸皮蛋白溶液的起泡性和气泡稳定性较好，分别为52%和37%；当pH 4.0时，麸皮蛋白溶液的溶解度最小，只有27%。

试验中得到的结果与王棐等[9]、王龙飞等[10]的结果对比得出：乳化性、乳化稳定性、起泡性、气泡稳定性、溶解性都受到pH、温度、含油量、离子强度和超声波处理中某些因素的影响。

3 结论

通过正交试验对超声波辅助碱法提取麸皮蛋白进行优化，得到最佳提取工艺：料液比1∶25（g/mL）、提取温度50 ℃、提取时间45 min、提取pH 11.5。在此条件下麸皮蛋白的得率为25.75%，并对优选的结果进行3次重复试验，表明该工艺稳定高效。特性试验得出乳化性的最大值是69%，乳化稳定性是64%，起泡性最大值是52%，气泡稳定性是37%，溶解度最小值是27%。该试验为将来藜麦麸皮蛋白的开发提供一定的理论依据。