感染柑橘黄龙病对‘沃柑’秋梢叶片理化指标和果实品质的影响*

黄世炎，张艺琴，杨 壹，蒙运铎，廖泽函，黄桂香

（广西大学农学院园艺系，南宁 530005）

‘沃柑’原产于以色列，2004 年由中国农业科学院柑桔研究所从韩国引进，该品种具有树势强、优质、晚熟、早实丰产等特性[1]。在广西、云南等地区有大面积种植，其中广西种植面积已超过10万hm2[2-3]。黄龙病是‘沃柑’等柑橘类的毁灭性病害，病原菌为专性寄生韧皮部的革兰氏阴性细菌，分为3 个亚种，即亚洲种（CandidatusLiberibacter asiaticu ）、美洲种（CandidatusLiberibacter americanus）和非洲种（CandidatusLiberibacter africanus）[4-5]。全球大多数柑橘产区危害严重，华南地区为黄龙病发生流行区，目前仍无有效的防治方法，生产上主要采用“种植无病毒苗木、防控木虱和清除病树”的“三板斧”法，树体管理、田间诊断等对防控黄龙病流行有重要意义。本研究对健康和感染黄龙病的‘沃柑’秋梢叶片的形态、生理生化指标、营养元素和果实品质进行检测并比较分析，以期为柑橘黄龙病的综合防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2020 年9—12 月在广西壮族自治区南宁市广西大学农学院标本园进行，供试品种为‘沃柑’，试验期间除加强木虱防控外，其他均为常规田间管理。通过黄龙病菌定量检测，检测出黄龙病阳性株（感病株）和阴性株（健康株），并从感病株和健康株中各选取5 株，分别采集感病株新叶、感病株成熟叶、健康株新叶、健康株成熟叶、感病株果实、健康株果实。新叶为秋梢已经完全展开的叶片，成熟叶为秋梢已经老熟的叶片。采集的叶片为树冠东、西、南、北、中5 个方位的秋梢上的第3～4 片叶。每株树分别采集树冠下层的果实10 个，中上层的果实20 个，共30 个果实。

1.2 试验方法

1.2.1 黄龙病检测

使用混合叶样，参考刘丽等[6]的方法提取DNA。再参考Bao 等[7]的方法对CLas 进行qPCR 检测，上游引物为HLBas（TCGAGCGTATGCAATACG），下游引物为 HLBr（GCGTTATCCCGTAGAAAAAGG TAG），探针为HLBp（FAM-AGACGGGTGAGTAA CGCG-BHQ）。使用仪器为qPCR 仪（LightCycler®96 lnstrument，美国）。以超纯水为空白对照，实验室保存的黄龙病菌样品为阳性对照，健康‘沃柑’叶片为阴性对照。

1.2.2 叶片长度和宽度的测定

采样后，使用国产电子数显卡尺（桂林量具刃具有限责任公司）测量叶片长度和宽度。

1.2.3 叶片叶绿素相对含量的测定

叶片叶绿素相对含量（SPAD 值）用MultiSpeQ多功能植物测量仪（PhotosynQ，美国）在田间实地测量，每株树选取东、西、南、北、中5 个方位，测量秋梢新叶片和成熟叶片的叶绿素相对含量。

1.2.4 叶片生理指标的测定

叶片生理指标过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量使用酶活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）进行测定，严格按照试剂盒说明书步骤进行操作，利用UV-8000 型双光束紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）测定OD 值，最后计算酶活性。

1.2.5 叶片矿质元素含量的测定

叶片N 含量使用H2SO4-H2O2消煮法-FIA 法[8]进行测定；P、K 含量使用H2SO4-H2O2消煮法-ICP法[9-10]测定；Ca、Mg、Cu 和Zn 含量采用盐酸浸提-ICP 法进行测定[11]。测定仪器为BDFIA-9000（北京宝德仪器有限公司）、ICP-5000（北京吉天仪器有限公司）。

1.2.6 果实品质相关指标的测定

人工统计每株柑橘树的果实总数，并随机采集果实，用于测定果实品质相关指标。使用SQP 电子天平（Sartorius，北京）称量单果重；使用电子天平称量经手动榨汁机处理后的果汁重量，计算出汁率；使用电子数显卡尺测量果皮厚度；使用PAL-BX/ACID1 柑橘糖酸度计（ATAGO，日本）测定糖酸比；采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]测定果实维生素C 含量。

1.3 数据处理

使用SPSS 18.0 软件对试验数据进行统计和分析，利用Excel 2019 软件对统计结果进行制图。

2 结果与分析

2.1 感染黄龙病对‘沃柑’叶片大小的影响

如图1 所示，感病株成熟叶片的平均长度显著小于健康株成熟叶片，分别为74.51 mm 和81.11 mm；而感病株和健康株的新叶平均长度分别为68.36 mm 和72.50 mm，且二者间无显著差异。感病株成熟叶的平均宽度也显著小于健康株成熟叶，分别为34.09 mm 和38.05 mm；感病株和健康株的新叶平均宽度分别为30.09 mm 和31.68 mm，二者之间也无显著差异。可见，与‘沃柑’健康株相比，感染黄龙病会影响‘沃柑’叶片的生长发育，使成熟叶片的长度和宽度显著小于健康株，但对新叶的长度和宽度均无显著影响。

图1 ‘沃柑’黄龙病株与健康株的叶片长度和宽度

2.2 感染黄龙病对‘沃柑’叶片叶绿素相对含量的影响

如图2 所示，感病株成熟叶片的叶绿素相对含量（SPAD 值）为53.65，显著低于健康株成熟叶片（63.17）；感病株和健康株新叶中的叶绿素相对含量分别为31.10 和34.77，二者之间无显著差异。这一结果说明感染黄龙病会显著影响‘沃柑’叶片的光合作用。

图2 ‘沃柑’黄龙病株与健康株的叶绿素相对含量

2.3 感染黄龙病对‘沃柑’叶片生理指标的影响

由表1 可以看出，与‘沃柑’健康株相比，感病株新叶和成熟叶片的CAT 活性均显著降低，分别降低了558.76、659.74 U/g；PAL 活性均显著增加，分别增加了35.39、83.04 U/g。但新叶和成熟叶片的SOD、POD 活性和MDA 含量在黄龙病株与健康株之间均未表现出显著性差异。

表1 ‘沃柑’黄龙病株与健康株的叶片酶活性

2.4 感染黄龙病对‘沃柑’叶片营养元素的影响

由表2 可知，与‘沃柑’健康株新叶相比，感病株新叶的N、P、K 含量均显著降低，分别降低了17.42%、22.73%、28.75%；Ca、Cu、Mg、Zn 含量均无显著差异。与‘沃柑’健康株成熟叶片相比，感病株成熟叶片的P、K 含量均显著降低，分别降低了36.36%、22.96%；Ca、Cu 含量均显著增加，分别增加了61.72%、30.36%；N、Mg、Zn 含量均无显著差异。可见，感染黄龙病对‘沃柑’叶片矿质元素含量有一定的影响。

表2 ‘沃柑’黄龙病株与健康株的叶片矿质元素含量

2.5 感染黄龙病对‘沃柑’果实品质的影响

2.5.1 结果数量和果实品质

从表3 可以看出，与‘沃柑’健康株相比，感病株的单果重、出汁率和糖酸比均显著降低，分别降低了33.22%、5.33%和14.31%；果实维生素C 含量却显著增加，增加了850.8 mg/kg。此外，感病株的单株结果数和果皮厚度和健康株相比均无显著差异。

表3 ‘沃柑’黄龙病株与健康株的果实品质

2.5.2 种子败育情况

由表4 可知，感病株和健康株果实种子总数无显著差异，但感病株果实的败育种子数和败育比均显著增加。

表4 ‘沃柑’黄龙病株与健康株败育种子情况

3 结论与讨论

3.1 感染黄龙病对‘沃柑’叶片大小的影响

众多研究均表明，黄龙病菌的侵染通过影响柑橘植株对营养元素的吸收、光合作用以及其他新陈代谢，从而影响感病后新生叶片的发育，导致成熟后叶片变小。Bové[4]在其对黄龙病的研究中也指出，柑橘植株感染黄龙病后叶片会出现黄化、变小等症状，该结论与本文感染黄龙病‘沃柑’叶片大小变化相一致。

3.2 感染黄龙病对‘沃柑’叶片生理指标的影响

植物抗性与其形态、结构以及自身的MDA、PAL 等生理生化物质相关，当植物体受到病原菌侵染时会引起相应的变化，如叶片细胞膜透性增加、叶绿素含量下降、MDA 含量提高等[13-15]。逆境会刺激CAT 活性升高，同时又会使植物组织受到损害而后使CAT 活性降低[16]。易龙等[17]在柑橘黄龙病菌侵染对‘纽荷尔’脐橙组织的研究中发现，黄龙病菌侵染会使叶片叶绿素含量降低，使POD、CAT、SOD活性和MDA 含量显著升高。本研究亦发现感病株成熟叶片的叶绿素相对含量显著下降，PAL 活性显著升高，与上述研究结果一致；CAT 活性显著降低，说明感染黄龙病对其部分组织已造成损伤。

3.3 感染黄龙病对‘沃柑’叶片矿质元素的影响

感染黄龙病会影响叶片矿质元素的含量，其原因与黄龙病感染使柑橘根系受损、韧皮部阻塞，进而影响根系对矿质元素的吸收有关。Razi 等[18]在其柑橘植物营养概况与黄龙病的研究中发现，感染黄龙病会使叶片N、Ca、Mg、Zn 含量降低。管冠等[19]在黄龙病对‘纽荷尔’叶片营养的研究中发现，Ca含量在黄龙病株中显著增加。同时，曹继容[20]研究发现，不同柑橘品种和不同季节的叶片N、P 含量的变化会有所差异。本研究中，与健康株相比，感病株新叶的N、P、K 含量均显著降低；成熟叶片的Ca、Cu 含量显著增加，K、P 含量显著降低，而Mg和Zn 含量均无显著变化。

3.4 感染黄龙病对‘沃柑’果实品质的影响

黄龙病病原菌侵染后，柑橘韧皮部受阻，阻碍了光合产物的运输，同时感染黄龙病后叶片光合作用下降，使光合产物的积累减少，因此导致黄龙病株单果重、糖酸比、出汁率均显著下降[21-23]。本研究通过对单果重、出汁率、糖酸比等指标的测定，亦得出相同结论。

相关研究表明，果实中维生素C 含量与矿质元素Ca、Zn 的含量呈正相关[24]。王飞燕等[25]以‘沙田柚’为试材的研究表明果实维生素C 显著升高，而刘家容等[26]以‘春甜橙’为试材的研究结果相反。王圣通[27]在黄龙病对柑橘果实品质的影响中亦指出不同试验材料品种会有不同的结论。推测研究结果不一致的原因可能是由于试验材料品种不同所导致。在本研究中，与‘沃柑’健康株相比，感病株果实维生素C 含量显著增加，这可能与感病株叶片Ca 含量升高有关，具体原因还需进一步研究。

本研究还发现，感病株与健康株的种子总数无显著性差异，但败育种子数却显著增多，说明感染黄龙病会导致‘沃柑’果实种子败育。王飞燕等[25]以‘沙田柚’的试验材料亦发现相同结果。

综上，感染黄龙病对‘沃柑’秋梢叶片大小及其相关理化指标有一定影响，同时也对果实品质产生影响。因研究时间有限，本文未包括不同季节叶样比较和年度间重复比对，有待进一步研究完善。