基于生物碱和多糖含量探究栽培和野生附子、乌头的差异

杨 硕，孙美玲，张 荳，宋肖桦，刘 鹏，李 飞，胡慧华*

0 引言

附子为毛莨科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，辛、甘，有大毒，归心、肾、脾经，具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛功效[1]。川乌为其干燥母根，辛、苦，热，有大毒，归心、肝、肾、脾经，具有祛风除湿，温经止痛之功[1]。

张仲景最善广泛使用附子、乌头，《伤寒杂病论》[2]中含有附子的方有20首，《金匮要略》[3]中含有附子的方有13首，大多用于治疗少阴相关病证，起到鼓舞阳气、补火助阳、散寒止痛、通痹利水等作用，如：四逆汤、附子汤、真武汤、麻黄附子汤。经查阅《伤寒杂病论》《李濂医史》《历代名医蒙求》《南阳人物志·古琴记》等相关文献可知张仲景为今河南省南阳市人，其采药以及使用的附子应该来自南阳附近的山上，前期课题组实地探访南阳市的张仲景祠，也认为其使用的附子可能为南阳附近的野生附子[2-6]。现在使用的附子大多来源为栽培品种，尤以四川江油产量最大、质量最佳，是公认的道地栽培区[7]。

经对《伤寒论》《金匮要略》中附子、乌头用量进行统计，发现张仲景使用附子、乌头是以枚为计量单位，现在附子、乌头均使用的是栽培品，完全仿照张仲景方中的附子、乌头以枚为剂量单位已经不适用了，因此，无法参照《伤寒论》、《金匮要略》中计量和现在的计量进行对等换算，对于如何在临床上正确掌握附子、乌头的用量是一个很重要的问题，因此，本实验通过测定张仲景使用的南阳附子、乌头和现今使用的江油附子、生川乌生物碱和多糖的含量，为研究张仲景使用的南阳附子、乌头和现今使用的江油栽培附子、生川乌的差异提供依据，从而进一步探究栽培品与野生品的用量，指导临床用药。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 SB25-12 DTD型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Waters2498 Waters高效液相(DAD 检测器、自动进样器、在线脱气、四元泵)；BT125D型十万分之一分析天平(Sartorius)；PH902-Ad110型pH计(泰州市正大科教仪器设备厂)；18系列紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1.2 试剂 对照品新乌头碱(批号：110798-201106)、乌头碱(批号：110720-201111)、次乌头碱(批号：110799-201106)、苯甲酰新乌头原碱(批号：111795-201002)、苯甲酰乌头原碱(批号：111794-201102)、苯甲酰次乌头原碱标准品(批号：111796-201002)购于中国食品药品检定研究院；D(+)无水葡萄糖标准品(上海源叶生物科技有限公司，20160913)；氨水(批号：20160105)、异丙醇(批号：20150408)、乙酸乙酯(批号：20150818)、二氯甲烷(批号：20170320)、乙酸铵(批号：20150511)、三氯甲烷(批号：20160511)；蒽酮(批号：20161208)、浓硫酸(批号：20171028)、无水乙醇(批号：20161028)、丙酮(批号：20161002)、三氟乙酸(批号：20160128)购于北京化工厂；乙腈(批号：155758)、四氢呋喃(批号：163142)购于Fisher；冰醋酸(批号：20141018，天津市光复仪器厂)。

1.3 药物 江油生附片(江油中坝附子科技发展有限公司，批号分别为20140701、20150701、20160701)；江油生川乌(江油中坝附子科技发展有限公司，批号分别为20150912、20160901、20150901)；南阳生附子、乌头(2016年10月采于河南南阳，净制)，经中国食品药品检定研究院中药所张继主任药师鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根及母根。

1.4 统计学方法 数据采用SAS 9.30软件，数据比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 生物碱含量的测定

2.1.1 色谱条件 采用《中华人民共和国药典》法，Eclipse-C18为色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-四氢呋喃(25∶15)为流动相A，以0.1 mol/L醋酸铵(每1 000 ml含冰醋酸0.5 ml)为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速1.0 ml/min；检测波长235 nm，柱温30 ℃，进样量10 μl[1]。流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.1.2 对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品各1.89 mg、0.86 mg、0.36 mg、4.52 mg、6.01 mg、1.38 mg，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制混合标准溶液，即得。分别吸取混合标准溶液2 ml、1 ml、0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml、0.05 ml制成不同浓度的标准品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 采用《中华人民共和国药典》法，取南阳野生附子、乌头和江油栽培附子、生川乌每个样品各2份，适量，粉碎，过三号筛，各取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨试液3 ml，再精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 ml，称定重量，超声处理(功率400 W，频率40 kHz，水温在25 ℃以下)30 min，放至室温，再称定重量，加异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失重量，滤过，精密量取续滤液25 ml，40 ℃以下回收溶剂至干，精密加入异丙醇-二氯甲烷(1∶1)3 ml溶解残渣，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试液[1]。

2.1.4 含量测定 分别吸取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品溶液10 μl，注入高效液相中，绘制标准曲线(见表2)，分别吸取每个供试品的溶液10 μl连续进样2次注入高效液相中，计算含量(表3、表4)。

表2 6种生物碱对照品溶液的标准曲线

表3 附子、生川乌、乌头中6种酯型生物碱的含量平均值(n=4,g/g)

表4 附子、生川乌、乌头中单、双酯和总酯型生物碱含量的平均值(n=4,g/g)

2.2 多糖含量的测定

2.2.1 供试品溶液的制备 取南阳野生附子、乌头和江油栽培附子、生川乌各精密称取1 g。加入10 ml 95%乙醇水回流提取2次，每次2 h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，加入40 ml纯水于90 ℃恒温水浴锅中浸提2次，每次2 h，滤过，滤液浓缩至一定体积，加95%乙醇水使含醇量为80%，4 ℃冰箱中静置48 h，沉淀依次用乙醚、丙酮、无水乙醇洗涤2次，得粗多糖，将粗多糖溶于水，加水定容至250 ml，作为供试品溶液[8]。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密吸取浓度为 0.019 8 mg/ml葡萄糖对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分别置于6支干燥的具塞刻度试管中，各加纯水补至2.0 ml，缓缓加入新鲜配制的0.2%硫酸-蒽酮试剂8.0 ml，摇匀，沸水浴10 min，取出，冰水浴冷却，放置10 min，以相应试剂为空白，于592 nm处测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程 y=147.490 1 x-0.037 22，r=0.999 1。结果表明，葡萄糖在0.001 98～0.019 8 mg/ml内，线性关系良好。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 最大吸光度的确定及标准曲线的绘制 见图1、图2。

图1 最大吸光度的确定

图2 标准曲线的绘制

2.2.3.2 精密度试验 取1.98 mg/ml的标准品，按“2.2.2”项下方法测定多糖含量，重复6次。计算多糖含量分别为0.849 0%、0.855 7%、0.855 8%、0.855 8%、0.849 0%、0.849 0%，结果显示，RSD为0.62%，该方法精密度良好。

2.2.3.3 重复性试验 取江油生川乌0.48 g，按“2.2.1”项下方法操作制备6份供试品溶液,按“2.2.2”项下方法测定多糖含量。计算多糖含量分别为3.513 6%、3.506 8%、3.506 8%、3.513 5%、3.506 8%、3.506 8%，结果显示，RSD为0.11%，该方法重复性良好。

2.2.3.4 稳定性试验 取南阳生附子0.46 g，精密称定，按“2.2.1”项下方法操作制备供试品溶液，按“2.2.2”项下方法测定多糖含量，每4 小时测定1次，计算多糖含量分别为3.398 3%、3.384 8%、3.242 4%、3.357 6%、3.439 0%、3.506 8%，结果显示，RSD为2.29%，样品溶液在24 h内稳定。

2.2.4 附子多糖含量测定 精密吸取“2.2.1”项下各供试品溶液1 ml于具塞试管中，按“2.2.2”项下方法显色并测定吸光度，计算多糖含量(见表5)。

表5 附子、生川乌、乌头的多糖含量(g/g)

3 讨论

通过表4对比发现，南阳野生附子和乌头的单酯、双酯和总酯型生物碱显著均高于江油栽培附子和生川乌。双酯型生物碱含量上，江油附子和生川乌相差3倍，南阳附子和乌头相差6倍，这或许是张仲景在临床上区分使用附子和乌头发挥不同功效的原因。通过表5对比发现，南阳野生附子多糖含量与江油栽培附子差异无统计学意义，但是江油生川乌(栽培乌头)多糖含量显著高于南阳野生乌头。附子、生川乌、乌头的多糖含量高低依次是：江油生川乌>江油生附片>南阳生附子>南阳乌头。

生物碱和多糖均为附子的有效成分，具有调节免疫、抗肿瘤、保护心肌缺血、降低胆固醇、强心、抗炎、镇痛等药理作用[9-10]，研究显示，现今使用的江油栽培附子、生川乌和张仲景使用的南阳野生附子、乌头均含有6种单、双酯型生物碱和多糖，只是在生物碱和多糖的含量上相差很大，说明其在疗效方面存在强弱之分。

现今临床均是以栽培品代替野生品来配付张仲景经方显然是可行的，但在使用中要多总结栽培品的疗效满意度，确定一个合适的使用量，而不是完全按照经方的剂量使用，这样既可以保证经方的继续使用，也可以保证栽培乌头和附子的事业持续发展。因此，还需要进一步加强对栽培品和野生品的差异性研究，从而指导临床用药。