娄彻氏链霉菌与噻唑膦复配对南方根结线虫的防治效果

张欣 杨树 苟攀宁 薛应钰

（甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃兰州 730070）

在设施蔬菜生产中，连作重茬现象日益严重，南方根结线虫（Meloidogyne incognita）对蔬菜的危害逐年加重（李周容 等，2020；Victor et al.，2021），每年有30%的设施蔬菜受到南方根结线虫的侵染，造成产量损失20%～40%（Cao et al.，2014）。根结线虫已成为严重影响设施蔬菜产量的重要因素（刘晓宇 等，2020）。噻唑膦是常用的有机磷类杀线虫剂，具有很强的触杀作用，对根结线虫具有明显的防治效果（马涛 等，2017）。但频繁大量的使用会造成根结线虫抗药性增加（王泊理和赵江克，2019）。近年来有关生防放线菌防治南方根结线虫的研究已成为主要趋势（任玉鹏，2016；Bansa et al.，2020）。研究表明，从根结线虫卵上分离的红灰链霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47 具有杀线虫活性和卵孵化抑制作用，并可增加番茄产量（Jin et al.，2017）；海洋白浅灰链霉菌（Streptomyces albogriseolus）HA10002 和金色链霉菌（Streptomyces aureus）DA09202 对根结线虫有拮抗作用（曾庆飞，2011）；通过将化学农药与生物制剂复配的方式来防治南方根结线虫，既可以提高防治效率，还可以降低化学农药的用量（王文朝，2016）。

娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）ZZ-9 是由甘肃农业大学植物病害生物防治实验室前期分离保存的一株具有自主知识产权的生防放线菌（范万泽 等，2017），谢玉琴等（2019）发现放线菌ZZ-9菌株发酵液对小麦幼苗具有促生作用。

本试验通过研究不同比例的噻唑膦和娄彻氏链霉菌ZZ-9 复配以后对南方根结线虫二龄幼虫的杀线活性，以期减少化学农药的使用量并延缓根结线虫的抗药性，为蔬菜根结线虫的防治提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 娄彻氏链霉菌ZZ-9 菌株（专利保存号：CGMCCNo.15245）由甘肃农业大学植物病害生物防治实验室分离保存。

1.1.2 供试药剂 20%噻唑膦水乳剂（江苏辉丰生物农业股份有限公司）。

1.1.3 供试土样 2017 年7月采自甘肃省兰州市榆中县南方根结线虫发生较严重的地块，采用五点取样法取5～20 cm 土层的土壤，破碎后装入自封袋，4 ℃保存备用。

1.1.4 供试培养基 高氏合成1号（gauserime synthetic agar）培养基，小米浸汁培养液。

1.2 试验方法

1.2.1 南方根结线虫的繁殖和二龄幼虫的获得 采用盆栽感病番茄繁殖南方根结线虫。2019 年7月，将番茄种子催芽后播于采集的病土土样中，繁殖南方根结线虫。35 d 后，将植株根系取出并用流水冲洗表面泥土，用镊子挑取根部线虫卵块于2 mL 离心管中，用1%次氯酸钠振荡3 min，7 000 r·min-1离心1 min，收集沉淀，用无菌水冲洗3 次。将消毒后的卵囊置于室温条件下孵化10 d，每隔24 h收集二龄幼虫，用无菌水将其配制成200 条·mL-1的线虫悬浮液，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 ZZ-9 菌株活菌液的制备 将纯化保存的ZZ-9 菌株接种于高氏1号培养基，于28 ℃、相对湿度50%的条件下黑暗培养7 d。向150 mL 三角瓶中加入60 mL 高氏1号液体培养基，将ZZ-9 菌株菌饼（直径5 mm）挑取到三角瓶中，每个三角瓶接6 个菌饼，28 ℃、180 r·min-1振荡培养72 h，制成种子液；按照10%的接种量将种子液接入到80 mL 的小米浸汁培养液中，28 ℃、180 r·min-1振荡培养4 d 后，即为活菌液。

1.2.3 ZZ-9 菌株发酵滤液的制备 将活菌液在4℃、10 000 r·min-1条件下离心20 min，取上清液，用0.22 μm 微孔滤器过滤，即为无菌发酵滤液原液，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 噻唑膦溶液的制备 将有效成分含量为20%的噻唑膦用无菌水配制成有效成分含量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg·mL-1的噻唑膦溶液备用。

1.2.5 ZZ-9 菌株活菌液、发酵滤液杀线活性测定 将ZZ-9 菌株活菌液和发酵滤液原液分别稀释5、10、15、20 倍，将活菌液和发酵滤液的0（原液）、5、10、15、20 倍液分别加入无菌24 孔细胞培养板（直径20.0 mm）中，每孔加入300 μL，再加入10 μL 线虫悬浮液（200 条·mL-1），以加入300 μL无菌水和10 μL 线虫悬浮液为对照，每个处理3 次重复，每重复3板。密封后在25 ℃条件下保湿培养，分别于24 h 和48 h 观察并记录线虫的死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

死亡率（%）=死亡线虫数/供试线虫数× 100

校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/（100 -对照死亡率）× 100

1.2.6 ZZ-9 菌株发酵滤液与噻唑膦复配杀线活性测定 将ZZ-9 菌株发酵原液和5 个浓度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg·mL-1）的噻唑膦溶液分别以1V∶1V、2V∶1V、3V∶1V复配，利用涡旋振荡仪使其混合均匀。按照1.2.5 方法测定48 h 后的杀线活性。

1.3 线虫死亡情况的判断

采用体态法、挑针刺激法和NaOH 刺激法判断线虫死亡情况。在光学显微镜下，观察不同处理的南方根结线虫二龄幼虫存活情况。死亡的二龄幼虫虫体一般为僵直状态，存活的二龄幼虫虫体一般为弯曲状，且不断地游动；用挑针轻轻拨动虫体僵直的二龄幼虫，静止不动的即为死亡个体。最后一次观察时，向细胞培养板孔中滴入1%的NaOH溶液，在显微镜下观察，静止不动的即为死亡个体。

1.4 数据处理

采用Excel 2016 软件和DPS 软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 ZZ-9 菌株活菌液的杀线活性

ZZ-9 菌株活菌液原液及其不同浓度稀释液对南方根结线虫二龄幼虫均有毒杀作用，其中活菌液原液对二龄幼虫的毒杀效果最好，处理48 h 时死亡率、校正死亡率分别达38.89%、36.13%（表1）。相比原液，各浓度稀释液对二龄幼虫的毒杀作用显著下降，这可能是由于稀释后活菌液中的活菌浓度不足所导致。

表1 ZZ-9 菌株活菌液及不同浓度稀释液对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀作用

2.2 ZZ-9 菌株发酵滤液的杀线活性

ZZ-9 菌株发酵滤液及其不同浓度稀释液对南方根结线虫二龄幼虫均有毒杀作用，其中发酵滤液原液对二龄幼虫的毒杀效果最好，处理48 h 时死亡率、校正死亡率分别为23.48%、11.87%；随着发酵滤液浓度的降低，校正死亡率明显下降（表2）。

表2 ZZ-9 菌株发酵滤液及不同浓度稀释液对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀作用

2.3 噻唑膦溶液的杀线活性

随着噻唑膦浓度的增加和处理时间的增长，南方根结线虫二龄幼虫的死亡率逐渐上升，1.0 μg·mL-1噻唑膦处理48 h 的校正死亡率达到78.88%（表3）。

表3 不同浓度噻唑膦溶液对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀作用

2.4 ZZ-9 菌株发酵滤液与噻唑膦溶液不同比例复配的杀线活性

从表4 可以看出，处理48 h 后ZZ-9 菌株发酵滤液原液与噻唑膦溶液1V∶1V复配对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀作用显著，且噻唑膦溶液浓度越大对二龄幼虫的毒杀效果越好，1.0 μg·mL-1噻唑膦与等体积ZZ-9 菌株发酵滤液复配处理48 h 后校正死亡率为72.64%；3V∶1V复配对二龄幼虫的毒杀作用最弱，且对噻唑膦浓度不敏感。

表4 ZZ-9 菌株发酵滤液与噻唑膦溶液不同比例复配对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀作用

3 结论与讨论

放线菌能够通过代谢产生抗生素，诱导植物提高抗性来抑制病原菌的侵染，在生物防治中具有较强的应用前景。研究表明，娄彻氏链霉菌SR-1102对番茄枯萎病有较好的拮抗作用，能够抑制病原菌在土壤中的繁殖与侵染（刘琴 等，2020）。小链霉菌H-2 菌株对南方根结线虫具有较高的杀线虫活性，且对南方根结线虫卵囊孵化具有较好的抑制作用（陈井生 等，2015）。本试验结果表明，娄彻氏链霉菌ZZ-9 菌株活的菌液和发酵滤液均对南方根结线虫有毒杀作用，这与Mookkan 等（2019）的研究结果相似，娄彻氏链霉菌能够产生吡咯烷-2，4-二酮（Pyrrolidine-2，4-Dione），这种活性物质对模式生物丰年虾（Artemia salinaL.）无节幼体具有较强的毒性（LC50=106.75 μg·mL-1）。推测这种活性物质对南方根结线虫也具有一定的毒杀作用，但对于南方根结线虫的毒力强弱还需要对发酵滤液蒸馏萃取之后进行验证。

目前，噻唑膦作为市面上防治根结线虫的主要产品，对根结线虫的防治效果较为理想（表3）。其作为主要的有机磷类杀线虫剂，通过抑制线虫体内乙酰胆碱酯酶的活性阻碍线虫的神经传导而毒杀线虫。但是，由于长期大量使用噻唑膦，线虫出现了不同程度的抗药性（杨波 等，2016）。研究表明，该杀线剂只是起到麻痹线虫的作用，虫体仍有复苏的可能，进而会诱导线虫产生抗药性（张博，2002）。同时，由于化学农药的大量使用对生态平衡、食品安全等造成了严重影响，国家提出了化学农药减施增效战略（徐长春，2018）。因此，对根结线虫开展生物防治研究迫在眉睫。本试验结果表明，ZZ-9 菌株发酵滤液原液和1.0 μg·mL-1噻唑膦等体积复配（每300 μL 复配溶液中噻唑膦原药的含量为150 ng，即复配溶液中噻唑膦浓度为0.5 μg·mL-1），处理48 h 后南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率为72.64%，与单一使用0.6 μg·mL-1噻唑膦（校正死亡率为56.84%）相比，复配溶液的杀线效果上升了15.80 百分点，接近单一使用1.0 μg·mL-1噻唑膦溶液的杀线效果（校正死亡率78.88%）。通过生防菌与化学药剂复配，减少了化学药剂使用量，为在根结线虫的防治过程中减施增效和延缓抗药性提供了新的途径。

尽管本试验在室内可控条件下显示出了良好的杀线效果，但是生物制剂在实际应用中受到环境、土壤等多种因素的限制（金娜 等，2015），因此，对该混配剂的田间防治效果还需进一步研究。