甜椒抗象耳豆根结线虫种质资源筛选

苗悦 姜秉政 曹振木 成善汉 汪志伟 包文龙 朱婕*

（1 海南大学园艺学院，海南省热带园艺作物品质调控重点实验室，海南海口 570228；2 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南海口 571101）

根结线虫（Meloidogynespp.）是世界农业生产中最难控制的植物病原线虫之一（Castagnone-Sereno，2012；Barbary et al.，2015），侵染寄主根系后，侧根与须根膨大形成根瘤，严重破坏寄主对水分和营养物质的吸收（Elling et al.，2011）。且根结线虫侵染时产生的伤口易导致疫病、枯萎病、立枯病等土传病害的再侵染（郑井元和朱春晖，2013）。我国从南到北各蔬菜产区均不同程度地受到根结线虫的危害（李英梅 等，2008），造成的经济损失日益加重。目前已发现的根结线虫有100 多种（陈慧 等，2016），其中象耳豆根结线虫（Meloidigyne enterolobii）侵染能力较强，在热带、亚热带地区造成的危害越来越严重，且被报道的寄主也在逐渐增多（Santos et al.，2019）。有研究发现，象耳豆根结线虫能克服Mi、N等已知的根结线虫抗病基因，可对农作物生产造成严重的经济损失（Kiewnick et al.，2009）。因此急需筛选和鉴定新的抗病种质，发掘更多的抗病基因，以扩充抗象耳豆根结线虫的种质资源库。

甜椒是我国广东、福建、广西、海南等地区广泛种植的蔬菜（卓侃 等，2008；刘大伟 等，2015）。象耳豆根结线虫极易侵染甜椒，一旦发生将给甜椒生产造成巨大的经济损失。然而，目前鲜见关于甜椒对象耳豆根结线虫的抗性评价。本试验利用5 个病情指标，对31 份甜椒种质进行了象耳豆根结线虫的抗性鉴定，筛选抗病种质资源。初步鉴定这些种质的抗病性可能基于多个不同的抗病机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的31 份甜椒种质资源均来自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所（表1）。

表1 供试甜椒种质名称及形态特征

1.2 试验方法

1.2.1 象耳豆根结线虫的保存与扩繁 从患病甜椒的根部挑取根结线虫卵粒，孵化出二龄幼虫。在海南省热带园艺作物品质调控重点实验室利用分子鉴定手段确定其为象耳豆根结线虫（姜秉政 等，2021）。将二龄幼虫接种到蕹菜（空心菜）根部进行活体保存和扩繁。

1.2.2 象耳豆根结线虫接种方法 2020 年5—7月在海南大学园艺学院植物培养室完成甜椒幼苗的种植和接种工作。将草炭、椰糠、蛭石和珍珠岩按照6V∶2V∶1V∶1V混合均匀后高压灭菌，作为甜椒栽培基质。2020 年5月，对甜椒种子进行浸种催芽，随机播到盛有灭菌土的21 孔穴盘中。待幼苗长至4 片真叶时，每份种质材料选择长势良好、大小一致的幼苗6 株，分别接种象耳豆根结线虫。

挑取象耳豆根结线虫卵粒，25 ℃黑暗条件下孵化，收集孵化的二龄幼虫，配制成1 000 条·mL-1的悬浮液，每株接种悬浮液1 mL，用移液枪分4 次注射到甜椒幼苗根际土壤中，深度为2～5 cm。接种60 d 后进行抗病性鉴定。

1.2.3 甜椒象耳豆根结线虫抗性鉴定 将植株整株带土拔出，清水浸洗，滤纸吸干水分，测定须根质量，并分别对根系上的根结、卵粒及卵进行计数，根据刘大伟等（2015）的方法对发病植株进行发病等级评价（表2），计算根结指数（GI）、卵粒指数（EI）、病情指数（DI）、繁殖系数（RF）和生殖指 数（RI）（Boiteux &Charchar，1996；Gonçalves et al.，2014；刘大伟等，2015；Marques et al.，2019）。

表2 辣椒根结线虫发病等级分级标准

根结指数（GI）=单株根结数/单株根鲜质量

卵粒指数（EI）=单株卵粒数/单株根鲜质量

病情指数（DI）=∑（各级病株数×相应级别数）/（调查总株数×最高级数值）× 100

繁殖系数（RF）=单株卵数/单株初始接种量

生殖指数（RI）=待测种质每克根平均卵数/感病对照每克根卵数× 100

各种质病情指标的数值越小，表示抗性越强；RF ＜1 的种质被认为具有根结线虫抗性；RI ＜50的种质被认为具有根结线虫抗性。免疫（I）：病情指数=0；高抗（HR）：0 ＜ 病情指数 ≤ 20.0；中抗（MR）：20.0 ＜ 病情指数 ≤ 40.0；抗病（R）：40.0 ＜ 病情指数 ≤ 60.0；感病（S）：60.0 ＜ 病情指数 ≤ 80.0；高感（T）：病情指数 ＞ 80.0。

本试验选取的感病对照为06SCa12-S，其根结覆盖率超过80%，根结指数为211.12；卵粒指数为44.45；病情指数为84.00，表明高感根结线虫；繁殖系数为7.11，大于1，表明对根结线虫无抗性。

1.2.4 甜椒对象耳豆根结线虫抗性综合评价 参考王沛琦等（2021）的方法，运用SPSS 22.0 软件对31 份甜椒种质进行隶属函数值分析，评价其对象耳豆根结线虫抗性。由于病情指标值与根结线虫抗性呈负相关，故隶属函数值计算公式为Xμ=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）。其中X为种质某一指标的测定值，Xmin、Xmax分别为所有供试种质某一指标的最小值和最大值。隶属函数值越大，抗象耳豆根结线虫的能力越强。

1.2.5 数据处理 试验数据采用Microsoft Excel 2018 软件和SPSS 22.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 象耳豆根结线虫侵染对甜椒病情指标的影响

不同甜椒种质对象耳豆根结线虫的抗性有较大差异。从根结指数来看，06SCa67M 根结指数最小，抗象耳豆根结线虫能力最强；06SCa59-S根结指数最大，抗象耳豆根结线虫能力最弱。从卵粒指数来看，06SCa20-S 卵粒指数最小，抗象耳豆根结线虫能力最强；06SCa13-S 卵粒指数最大，抗象耳豆根结线虫能力最弱。从病情指数来看，06SCa42-1、06SCa66M、06SCa69-S 的病情指数在16～20 之间，表现为高抗；06SCa40-1、06SCa52-1、06SCa59-S、06SCa67M、06SCa78-2、06SCa82-1 的病情指数在20～40 之间，表现为中抗；06SCa7-1、06SCa8-S、06SCa11-1、06SCa17-S、06SCa18-S、06SCa20-S、06SCa29-S（M）、06SCa33-1、06SCa43-2、06SCa44-2S、06SCa63-1、06SCa65-S、06SCa70-M、06SCa83-1的病情指数在40～60之间，表现为抗病，06SCa9-2、06SCa13-S、06SCa14-S、06SCa16-S、06SCa28-S、06SCa45-2S、06SCa75-2S 的病情指数在60～80 之间，表现为感病；06SCa12-S（感病对照）的病情指数大于80，表现为高感；无免疫品种（表2、3）。从繁殖系数来看，06SCa78-2繁殖系数最小，为0.33，抗象耳豆根结线虫能力最强；06SCa14-S 繁殖系数最大，抗象耳豆根结线虫能力最弱；31 份甜椒种质中，06SCa11-1、06SCa17-S、06SCa40-1、06SCa42-1、06SCa59-S、06SCa69-S 和06SCa78-2 的繁殖系数均小于1，表明对象耳豆根结线虫具有一定的抗性。从生殖指数来看，06SCa17-S 生殖指数最低，抗象耳豆根结线虫能力最强；06SCa28-S 生殖指数最高，抗象耳豆根结线虫能力最弱；31 份甜椒种质中，06SCa16-S、06SCa17-S、06SCa20-S、06SCa33-1、06SCa40-1、06SCa63-1、06SCa65-S、06SCa75-2S、06SCa82-1、06SCa83-1 10 份材料生殖指数均小于50，表明对象耳豆根结线虫具有一定抗性（表3）。

表3 象耳豆根结线虫侵染对甜椒种质病情指标的影响

2.2 象耳豆根结线虫侵染后甜椒相关抗病指标的综合评价

综合各病情指标来看（表4），06SCa69-S 的隶属函数值之和最大，为4.85，表明其抗象耳豆根结线虫能力最强；06SCa13-S 的隶属函数值最小，为1.29，表明其抗象耳豆根结线虫的能力最弱；筛选出抗性较强的甜椒种质06SCa69-S、06SCa52-1、06SCa67M、06SCa66M、06SCa78-2 等。

表4 象耳豆根结线虫侵染甜椒后相关病情指标的隶属函数值

3 讨论与结论

象耳豆根结线虫的危害日益严重，选育并种植抗病品种是最经济有效的防治方案。前人研究并筛选出了一批对象耳豆根结线虫具有抗性的辣椒品种（Gonçalves et al.，2014；Marques et al.，2019；Carrillo-Fasio et al.，2020；Pinheiro et al.，2020），但其中甜椒品种较少，本试验对31 份甜椒种质进行了象耳豆根结线虫抗性评价，综合考虑5 个病情指标和隶属函数值，筛选出抗性较强的甜椒种质为06SCa69-S、06SCa52-1、06SCa67M、06SCa66M和06SCa78-2 等。

本试验利用的5 个不同病情指标中根结指数、卵粒指数和病情指数与甜椒根系受象耳豆根结线虫侵染的程度紧密相关，而繁殖系数和生殖指数则主要与象耳豆根结线虫侵染甜椒根系后的种群繁殖情况紧密相关。病情指数和繁殖系数在相关研究中常作为根结线虫抗性的重要判断依据。如刘大伟等（2015）以病情指数为依据，从24 份辣椒中筛选出11 份南方根结线虫的高抗品种。Pinheiro 等（2020）从37 份辣椒材料中鉴定出1 份RF ＜1 的种质，认为其具有对象耳豆根结线虫的抗性。本试验依据病情指数和繁殖系数分别筛选出的抗病种质并不完全重叠，表明甜椒的根结线虫抗性机理可能存在多样性，如部分甜椒种质可能通过降低根结线虫的侵染率或影响取食点的形成，降低根结在根系中的占比；而另一些种质可能影响根系中根结线虫的发育，降低其产卵率和卵量，进而从根本上减小根结线虫的种群规模，初步鉴定这些种质的抗病性可能基于多个不同的抗病机理。

与前人研究相比，本试验观测到的甜椒根结指数和卵粒指数均偏大，推测有两方面原因：一方面可能是象耳豆根结线虫本身的侵染能力强于其他主要根结线虫类群。有研究利用爪哇根结线虫、南方根结线虫和象耳豆根结线虫分别侵染同样的辣椒种质，发现象耳豆根结线虫侵染辣椒产生的根结指数明显高于其他两种根结线虫（Pinheiro et al.，2020）。另一方面本试验在2020 年夏季进行，夏季的高温可能是产生大量根结的一个重要原因。高温下根结线虫活力增强，传代速度加快，导致其侵染性增强。且已知的辣椒根结线虫抗病基因，在高温下多数基因表达受影响，从而导致辣椒的抗性降低甚至消失（郑井元和朱春晖，2013）。Pinheiro 等（2020）分别在不同季节开展根结线虫抗病性鉴定研究，发现夏季检测到的根结指数高于冬季。基于象耳豆根结线虫的强致病性和在高温环境下，本试验获得的高抗种质的抗性机理值得进一步深入研究。