龙胆苦苷基于尿酸转运蛋白和NLRP3炎性小体信号通路 改善小鼠高尿酸血症和肾脏炎症

区淑雅，李灿涛，邵颖颖，谢保城，胡润凯（广东省东莞市人民医院，广东 东莞 523000）

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）的直接诱因是人体嘌呤代谢紊乱造成体内尿酸生成过多或排泄不足，可引发肾结石和间质性肾炎等肾脏损伤[1]。目前，高尿酸血症与高血压、高血糖、高血脂并称为“四高”代谢性疾病[2]。尿酸（uric acid，UA）是来源于动物嘌呤的最终产物，主要在肝脏合成，经肾脏排泄[3]。随着社会生活水平的提高，人们在日常饮食中往往会摄入过量的嘌呤，造成体内尿酸浓度过高而增加患高尿酸血症的风险。同时，尿酸可诱导炎症介质的分泌，增加促炎因子的生成和释放，上调肾脏炎症水平，造成肾脏的炎性损伤[4]。临床上治疗高尿酸血症的临床药物主要有三类：黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）抑制剂、尿酸盐阴离子转运蛋白1（urate anion transporter 1，URAT1）抑制剂和尿酸氧化酶类似物，这类药物对肝、肾和肠道的不良反应严重影响患者的康复进程和生活质量[5-6]。因此，寻找有效、不良反应少的高尿酸血症治疗药物显得尤为重要。

中医目前对高尿酸血症无统一的辨证标准，有中医学家综合脏腑、经络、病因病机等因素，将高尿酸血症的证型归为湿热蕴结，故常用具有清利湿热功效的中药进行治疗[7-8]。龙胆是我国传统的珍贵中药材，具有清热燥湿、泻肝胆火的功效，常用于湿热蕴结于下焦之证[9]。龙胆苦苷（gentiopicroside，Gent）是龙胆的主要活性成分，同时也是存在于龙胆、秦艽等龙胆科植物中的环烯醚萜苷类化合物。现代药理研究报道龙胆苦苷具有抗炎镇痛、降血糖等作用[10]。已有研究证明，龙胆苦苷可抑制肝脏中NLRP3炎性小体的表达，减少促炎因子的生成和释放，下调炎症水平。然而龙胆苦苷在肾脏是否同样具有抑制炎症反应从而保护肾脏的作用尚未有明确报道。基于此，本研究分析龙胆苦苷对小鼠高尿酸血症的降尿酸作用和对肾脏NLRP3炎性小体信号通路的影响，进一步阐释龙胆苦苷对高尿酸血症小鼠的疗效以及对肾脏炎症的改善作用。

1 材料

1.1 动物

60只雄性昆明小鼠购自广东省医学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK2020-0090。小鼠体质量18～23 g，饲养温度：23～25℃，湿度45%～55%，每日光照12 h，动物自由食用标准饲料和自由饮用蒸馏水。

1.2 试药

龙胆苦苷（默克Sigma Aldrich公司，批号：20200703-2，纯度≥ 98%）；羧甲基纤维素钠（批号：20200128）、别嘌呤醇（ALL，批号：20200311）、氧嗪酸钾（纯度≥ 97%，批号：20200351）（美国Sigma公司）。URAT1抗体（货号：AF14543）、有机阴离子转运蛋白1（OAT1）抗体（货号：AF27322）、OAT3抗体（货号：AF13328）、NLRP3抗体（货号：AF21232）、ASC抗 体（货 号：AF33461）、Caspase-1抗体（货号：AF22156）、山羊抗兔抗体（货号：AF43326）、山羊抗大鼠抗体（货号：AF48565）、猴抗小鼠抗体（货号：AF42241）（Affinity公司）；葡萄糖转运蛋白9（GLUT9）抗体（货号：AB14443）（Abcam公司）；IL-1β测定试剂盒（批号：20200522）、IL-18 测定试剂盒（批号：20200522）（江苏酶免实业有限公司）；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（货号：P0312）、蛋白酶抑制剂PMSF（批号：P0137）、RIPA裂解液（批号：P0112B）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0122S）（上海碧云天生物技术有限公司）；SYBR实时荧光定量（qPCR）试剂盒（批号：P10525）、PrimeScript RT反转录PCR试剂盒（批号：C10112）、RNAiso plus总RNA提取试剂（批号：C26433）（日本TaKaRa公司）；4%多聚甲醛（批号：MA3302，美仑生物科技有限公司）；尿酸（UA，货号：P29394）、肌酐（CRE，货号：P30324）、黄嘌呤氧化酶（XOD，货号：P26614）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 仪器

Elx808全波长多功能酶标仪（广州吉源生物科技有限公司）；Nano Drop 2000c超微量分光光度计、CFX96实时定量PCR仪（美国赛默飞生物科技有限公司）；伯乐垂直电泳槽、伯乐电泳仪（美国Bio-rad生物科技有限公司）；Tanon4600天能曝光仪（中国天能生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分组及干预方法

60只雄性昆明小鼠适应性饲养3 d后，按体质量随机分为对照组、模型组、阳性药ALL组、龙胆苦苷低剂量组、龙胆苦苷中剂量组和龙胆苦苷高剂量组，每组10只。实验期间，给予动物普通饲料和蒸馏水自由饮食。模型组、ALL组、龙胆苦苷低剂量组、龙胆苦苷中剂量组和龙胆苦苷高剂量组动物使用0.5%羧甲基纤维素钠（0.2 mL/10 g）为溶剂，腹腔注射氧嗪酸钾（300 mg·kg－1），连续注射15 d，构建高尿酸血症模型。对照组则腹腔注射等体积的蒸馏水。ALL组（5 mg·kg－1）、龙胆苦苷低剂量组（20 mg·kg－1）、龙胆苦苷中剂量组（40 mg·kg－1）和龙胆苦苷高剂量组（80 mg·kg－1）在腹腔注射氧嗪酸钾1 h后，分别对小鼠灌胃相应剂量的药物。对照组与模型组灌胃等体积的蒸馏水。

2.2 血清和脏器的收集

实验结束后，对小鼠进行乙醚麻醉，眼眶取血。4℃、3500 g离心血液15 min得血清，－80℃保存备用。随后对小鼠脱颈椎法处死，剖取肝和肾，－80℃保存备用。

2.3 尿酸、肌酐和黄嘌呤氧化酶的检测

分别剪取约0.5 g的肝组织加入到含有500 μL 磷酸盐缓冲液（PBS）的EP管中，匀浆，然后将所得匀浆液以3500 g离心10 min，取上清得肝上清液。采用BCA试剂盒检测肝上清液的蛋白浓度。按照试剂盒操作说明测定动物血清中的尿酸和肌酐，以及血清和肝脏中黄嘌呤氧化酶的含量。

2.4 IL-1β和IL-18的检测

分别剪取约0.5 g的肾组织加入到装有500 μL PBS的EP管中，匀浆，然后将所得匀浆液以3500 g离心10 min，取上清得肾上清液。采用BCA试剂盒检测肾上清液的蛋白浓度。按照试剂盒操作说明测定动物肾中IL-1β和IL-18，以及血清中IL-1β和IL-18的含量。

2.5 Western blot法检测小鼠肾GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3和NLRP3炎症小体通路

将小鼠肾组织浸泡于RIPA裂解液中，冰上裂解30 min，匀浆，提取总蛋白。12 000 r·min－1离心15 min，取上清液。采用BCA试剂盒测定肾组织蛋白浓度。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干转法将蛋白转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2.5 h，加一抗（GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3、NLRP3、ASC和Caspase-1）4℃冰箱孵育过夜；翌日加入相应二抗，孵育1 h，随后显色曝光，拍照并保存相应蛋白条带，使用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，与内参蛋白GAPDH的灰度值校准。

2.6 qPCR测定iNOS和CD206的mRNA表达

按试剂盒说明书，提取肾上清总RNA并检测RNA浓度，并保存于－80℃备用。使用反转录试剂盒，将RNA反转录成cDNA，并以此cDNA为模板，用SYBR Green PCR Master Mix和相应的引物进行扩增。反应条件为：95℃预变性，持续30 s，95℃变 性，持 续5 s，60℃退 火30 s，72℃延伸60 s，进行40个循环。所得数据均采用2-ΔΔct进行相对定量分析。引物序列见表1。

表1 引物序列 Tab 1 Primer sequence

2.7 统计方法

所有实验数据均采用±s的形式表达，应用SPSS 25.0软件对数据进行分析。组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐则采用LSD检验，方差不齐则采用Dunnett T检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 龙胆苦苷对高尿酸血症小鼠血清尿酸和肌酐水平的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清尿酸、肌酐水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性药ALL和各浓度的龙胆苦苷均能明显下调血清中尿酸、肌酐的含量（P＜0.01），且具有剂量依赖性。说明龙胆苦苷对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症具有明显的改善作用。

图1 各组小鼠血清尿酸（A）和肌酐（B）的含量Fig 1 Content of UA（A）and CRE（B）in each group

3.2 龙胆苦苷对高尿酸血症小鼠黄嘌呤氧化酶水平的影响

与正常组相比，模型组小鼠的血清和肝脏中的黄嘌呤氧化酶水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，ALL阳性药能显著下调黄嘌呤氧化酶水平（P＜0.01），同时龙胆苦苷各浓度也能下调血清和肝脏中的黄嘌呤氧化酶水平（P＜0.05，P＜0.01），且作用具有剂量依赖性（见图2）。

图2 各组小鼠血清（A）和肝脏（B）中黄嘌呤氧化酶的含量Fig 2 Content of XOD in serum（A）and liver（B）of each group

3.3 龙胆苦苷对高尿酸血症小鼠尿酸转运体蛋白水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠的GLUT9和URAT1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），OAT1和OAT3表达水平明显降低（P＜0.01）。与模型组相比，龙胆苦苷各剂量和阳性药ALL能明显降低GLUT9和URAT1蛋白表达水平（P＜0.01），升高OAT1和OAT3蛋白的表达（P＜0.05，P＜0.01），且龙胆苦苷降低各蛋白表达的作用具有剂量依赖性（见图3）。

图3 各组小鼠尿酸转运蛋白的相对表达量Fig 3 Relative expression of uric acid transporter-associated proteins in each group

3.4 龙胆苦苷对高尿酸血症小鼠尿酸转运体mRNA表达水平的影响

与正常组相比，模型组小鼠的GLUT9和URAT1 RNA表达水平显著升高（P＜0.01），OAT1和OAT3表达明显降低（P＜0.01）。与模型组相比，阳性药ALL和龙胆苦苷各个剂量均能升高小鼠的OAT1和OAT3表达（P＜0.01），且降低GLUT9和URAT1的表达（P＜0.01）（见图4）。

图4 各组小鼠尿酸转运蛋白mRNA的相对表达量Fig 4 Relative mRNA expression of uric acid transporter-associated proteins in each group

3.5 龙胆苦苷对高尿酸血症小鼠血清和肾脏炎性因子的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清中和肾脏中的IL-1β和IL-18的含量显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，龙胆苦苷各剂量以及阳性药ALL均能显著降低血清以及肾脏中IL-1β和IL-18的含量（P＜0.01）（见图5）。

图5 各组小鼠血清和肾脏IL-1β和IL-18的含量Fig 5 Content of IL-1β and IL-18 in serum and liver of each group

3.6 龙胆苦苷对高尿酸血症小鼠NLRP3炎性小体通路表达水平的影响

与正常组相比，模型组小鼠肾脏的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达显著上调（P＜0.01）。与模型组比较，龙胆苦苷各剂量组和ALL组小鼠肾脏中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达则明显降低（P＜0.05，P＜0.01）（见图6）。结果表明龙胆苦苷能够抑制NLRP3炎症小体信号通路的表达。

图6 各组小鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的相对表达量Fig 6 Relative expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in each group

3.7 龙胆苦苷对高尿酸血症小鼠NLRP3炎性小体mRNA水平的影响

与正常组相比，模型组小鼠肾脏中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，龙胆苦苷各剂量和阳性药ALL能够显著降低肾脏中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表达（P＜0.01）（见图7）。结果表明龙胆苦苷能够抑制NLRP3炎症小体信号通路的表达。

图7 各组小鼠NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA的相对表达量Fig 7 Relative mRNA expression of NLRP3，ASC and Caspase-1 in each group

4 讨论

流行病学研究表明，高尿酸血症的发病率逐年升高，且发病呈年轻化趋势，防控形势不容乐观[11]。已有研究报道高尿酸血症与尿酸生成过多和尿酸排泄减少密切相关[12-13]。临床上对抗高尿酸血症最广泛的药物为黄嘌呤氧化酶抑制剂，尽管其疗效显著，但药物所伴随的超敏综合征可影响患者康复进程[6，14]。中医认为，高尿酸血症属于“通风”“历节”和“虎咬风”等范畴，其病机在于脏腑亏虚、湿痰瘀阻和湿热蕴结[15-17]。龙胆具有清热燥湿、泻肝胆火的功效，尤善清下焦湿热，被认为是治疗高尿酸血症的潜在药物[9，18]。本研究结果表明龙胆苦苷可调控尿酸转运蛋白的表达，影响尿酸的排泄和重吸收，降低体内尿酸含量改善高尿酸血症，并抑制NLRP3炎性小体信号通路的表达，降低肾脏炎症水平，发挥改善小鼠高尿酸血症和肾脏炎症的作用。

目前，已经有许多小鼠模型用于研究高尿酸血症的分子机制。这些模型主要通过4种不同的方式提高体内尿酸的水平[19-21]：① 直接补充尿酸、尿酸前体或者高嘌呤食物，如黄嘌呤、次黄嘌呤、果糖或酵母；② 抑制尿酸排泄，可通过补充乙胺丁醇或者烟酸，抑制机体对尿酸的排泄能力；③ 抑制尿酸酶的活性，如氧嗪酸钾，可抑制尿酸酶的活性降低尿酸的分解，造成尿酸在体内的过度积蓄；④ 转基因模型，如通过对尿酸转运蛋白OAT1进行敲除，促使尿酸排泄受限制。其中，对动物进行氧嗪酸钾饲养、灌胃以及腹腔注射是目前使用最广泛的高尿酸血症造模方法[22]。区别于饲养法和灌胃法，腹腔注射氧嗪酸钾的操作既不影响动物的后期进食，也更能保证药物的摄入量[23]，故本研究采用对动物腹腔注射氧嗪酸钾的方法，并成功构建高尿酸血症模型。

尿酸转运蛋白主要分为两类：尿酸分泌蛋白和尿酸重吸收蛋白。作为尿酸分泌蛋白的主要成员之一，有机阴离子转运体家族有十余种亚型[24]。其中，OAT1和OAT3是参与尿酸分泌的关键蛋白，分布于近端小管上皮细胞的基底外侧。OAT1和OAT3摄取血液中尿酸的机制相似，二者均充当有机阴离子/酮戊二酸盐交换体的角色，将α-酮戊二酸排出的同时完成对尿酸的摄取，降低血液中尿酸的含量[25-26]。另一方面，尿酸重吸收蛋白包括URAT1和GLUT9。URAT1分布于近端小管的上皮细胞管腔侧或基底膜外侧。根据近端小管管腔两侧的浓度梯度和电化学变化，URAT1介导管腔内的尿酸与近端小管上皮细胞无机阴离子及有机阴离子的交换，进而促使尿酸转运至上皮细胞内。细胞内的尿酸经过位于近端小管上皮细胞基底外侧和顶端的GLUT9转移到肾间质，完成从尿液重吸收尿酸到血液的过程[27]。本次研究结果显示，各剂量的龙胆苦苷可明显上调高尿酸血症小鼠肾脏OAT1和OAT3的表达，同时显著抑制高尿酸血症小鼠肾脏GLUT9和URAT1的表达，减少近端小管上皮细胞对尿酸重吸收，并且增加尿酸的排泄，达到改善高尿酸血症的作用。

肾脏炎症是高尿酸血症的典型病理特征，在高尿酸血症的进展中起着关键作用。尿酸的过度积蓄会表现出细胞毒性作用[28-29]，其中的病理作用则包括诱导肾间质炎性浸润。尿酸的促炎作用主要体现在尿酸盐结晶和可溶性尿酸，通过激活核苷酸结合寡聚结构域3蛋白（NLRP3）炎性小体和肾小管上皮细胞NF-κB信号通路促进炎性细胞分泌促炎因子，上调肾脏的炎症水平，造成肾脏的炎性浸润[30-31]。尿酸及尿酸盐结晶激活NLRP3炎性小体[32]，NLRP3炎性小体通过模式识别受体3与凋亡相关点样蛋白（ASC）和胱天蛋白酶1的前体（Pro-caspase1）寡聚而成[33]。在正常的生理情况下，Pro-caspase1处于无活性状态。当NLRP3炎性小体激活，对Pro-caspase1进行加工并将其活化为具有活性的Caspase-1，进而对白细胞介素-1β（IL-1β）前体和白细胞介素-18（IL-18）前体进行剪切，生成和释放IL-1β和IL-18，参与多种炎症性疾病的发病进程[34-35]。在本研究中，高尿酸血症小鼠肾脏中IL-1β和IL-18含量上升，说明NLRP3炎性小体被激活，产生炎性因子增加对肾脏的炎性损伤。经龙胆苦苷干预后的高尿酸血症小鼠肾脏中IL-1β和IL-18含量下调，提示NLRP3炎性小体激活受抑制，降低肾脏炎症水平，改善肾损伤。

综上所述，龙胆苦苷可通过调控小鼠肾脏尿酸转运蛋白的表达，降低小鼠体内尿酸含量，发挥治疗高尿酸血症小鼠的作用，并且抑制尿酸过度积蓄诱导的肾脏NLRP3炎性小体的激活，降低肾脏炎症反应水平，缓解肾脏炎症。